2 水环境中致病菌的检测技术

近年来，水环境中致病菌的检测取得了一定的研究进展，已从单一基于培养法的传统致病菌检测方法发展至多种分子生物学检测方法，这些技术的出现和发展为致病菌检测提供了新的思路。水环境中致病菌检测技术的发展历程见图 1。

目前最普遍的致病菌检测方法是培养法和聚合酶 链 式 反 应 ( Polymerase Chain Ｒeaction， PCＲ) 。这 2 种方法在选择性和灵敏度方面都很突出，但培养法比 PCＲ 法更耗时。一些新兴的方法如生物传感器正在开发中，其未来的发展方向是满足低成本、高选择性要求。高通量测序由于通量高和无须特异性引物等优点正逐渐取代传统检测方法，但也存在错误率高等局限性。近年来致病菌检测方法的检测限及其应用见表 2。目前，致病菌检测方法还存在相似亚种难以区分、致病性及样品浓缩带来的抑制物等问题，这对新检测方法的开发是重大挑战。

2． 1 PCＲ 和实时定量 PCＲ PCＲ 是目前致病菌检测中应用最广泛的分子

生物学方法之一，其通过扩增特定的靶基因序列来完成致病菌检测。主要通过变性、退火和延伸( 退火和延伸也可以同时进行) 3 个步骤最终实现目标序列的指数放大。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准( SN/T 1896—2007) 中采用 PCＲ 技术对食品中的多种致病菌( 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌 O157: H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌) 进行快速定性检测。

实 时 定 量 PCＲ ( quantitative real-time PCＲ， qPCＲ) 是在 PCＲ 技术基础上利用荧光信号值实时检测目的基因，通过内参或外参法对样品中的特定基因进行定量分析，比常规 PCＲ 更为灵敏。已有大量研究采用 qPCＲ 方法定量致病菌，如大肠杆菌和沙门氏菌 等。分别采用qPCＲ 方法与传统培养法检测河口水样中大肠杆菌和肠 球 菌，发 现 qPCＲ 方法的检测限能达到1 CFU/100 mL，显著优于传统培养法。但是 qPCＲ也存在 DNA 回收效率低和对引物特异性要求高的问题。此外，qPCＲ 在检测中还面临其他一些挑战，如反应中存在 PCＲ 抑制物。即使少量的PCＲ 抑制物也会延迟复杂样品的阈值循环( Cq ) ，从而导致模板拷贝数比实际值低。为防止假阴性结果的出现，可在 PCＲ 反应中加入对抑制物具有高灵敏度的内部阳性对照( 如内参基因) 进行检测。此外，提取过程中残留的抑制物如胍盐和苯酚可采用 QuickDrop 和 NanoDrop 分光光度计检测，也可以通过凝胶电泳确定是否有 ＲNA、DNA 及蛋白污染。如果样品中含有蛋白等其他杂质的污染，可以使用磁珠进行核酸纯化。与此同时，qPCＲ 无法识别活菌或死菌，会产生假阳性结果。目前，一般 采 用 叠 氮 溴 化 丙 锭 ( propidium monoazide， PMA) 对样品进行前理，从而避免假阳性结果的产生。PMA 是一种高度光敏的 DNA 结合染料，不能透过完整的活细胞膜，却能选择性地透过不完整的死细胞膜。PMA 能与 DNA 结合形成不可逆共价键，抑制死细胞 DNA 的扩增以达到区分死、活细胞的目的。

此外，PCＲ 与 qPCＲ 对于致病菌的批量检测存在一定的局限性。针对上述问题，多重 PCＲ、微滴 式 数 字 PCＲ 等技术相继产生。多 重 PCＲ ( multiplex PCＲ，mPCＲ) ，又称多重引物 PCＲ 或复合 PCＲ，是在同一 PCＲ 反应管中同时加上多种特异性引 物 进 行 PCＲ 扩 增。微 滴 式 数 字 PCＲ ( Droplet Digital PCＲ，ddPCＲ) 是第三代 PCＲ 技术，属于单分子分析，可用于绝对定量。用 ddPCＲ 和 qPCＲ 计数河流环境中的沙门氏菌，发现水中 ddPCＲ 的灵敏度和线性范围与 qPCＲ 相当，但沉积物样品中 ddPCＲ 的灵敏度和线性范围明显更高。多重 PCＲ 和微滴式数字 PCＲ 技术都克服了传统 PCＲ 方法高成本、通量有限、流程复杂、精确度低等缺点。但是 mPCＲ 存在多目标扩增条件不相容的问题，ddPCＲ 检测高浓度样品时的线性度明显下降。

2． 2 等温扩增技术

近年来新发展起来的等温扩增技术，无论是实际操作还是仪器要求方面都比 PCＲ 技术更为简单方便，在临床和现场监测中具有良好的前景，其中，环介导等温扩增( LAMP) 已经得到一定的应用。该技术是一种新型的核酸扩增方法，其主要原理是使用 4 条特异性引物分别识别靶基因的 6 个特定区域，通过链置换反应实现等温条件下基因的快速扩增。该方法的优点是灵敏度高( 检测限比传统的 PCＲ 方法低 2 ～ 5 个数量级) 、反应时间短( 30 ～ 60 min) 、临床使用不需要特殊仪器和操作简单( 反应液、酶和模板的混合液置于 63 ℃ 左右水浴锅或恒温箱中 30 ～ 60 min) 。使用改性的 LAMP 定量分析地表中的大肠杆菌和伤寒沙门氏菌，灵敏度动态范围为 0． 3 ～ 10 000 cells/mL，高浓度抑制物对定量结果影响较小，且 1 h 内能够完成检测。LAMP 技术基于 4 ～ 6 个引物的结合，所以比 qPCＲ 扩增效率低，也常常因非特异性扩增出现假阳性结果。目前常用的防止假阳性结果出现的方法主要包括:

( 1) 使用特定结构的PCＲ 管，该管中有一个固定的小隔板将管分成 2 个区域，分别加入反应液和 DNA 染料，但这种方法增加了加液次数，不适用于大批量检测;

( 2) 将染料包埋在石蜡中，反应结束后高温熔化石蜡进而释放染料，但该方法增加了前处理时间。