采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组,具体方法和步骤参照试剂盒说明书。所提取的菌株DNA利用核酸蛋白分析仪和Qubit荧光定量测定仪检测基因组DNA的纯度和浓度,并送北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序。
经电泳检测合格的DNA样品用超声波破碎仪随机打断成长度约为350bp的片段,经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成文库制备。使用Qubit2.0和Agilent2100对构建好的文库进行初步定量和插入片段检测。插入片段符合预期后,使用Q-PCR对文库的有效浓度进行准确定量。文库检测合格后采用北京诺禾致源科技股份有限公司的IlluminaNovaSeq6000测序系统进行全基因组测序。对illumina测序平台的数据进行低质量过滤,包括去除无效信号、去除测序接头和锚定引物序列、去除复杂序列和重复序列,从而获得高质量的有效数据(CleanData)进行后续分析。使用SOAPdenovo软件进行组装,用RAST对组装序列进行注释(http://rast.nmpdr.org)。使用基因组流行病学中心(CenterforGenomicEpidemiology)CGE的默认阈值,对组装序列进行鉴定(http://www.genomicepidemiology.org),利用ThePathosystemsResourceIntegrationCenter(PATRIC)对基因组组成进行分析(https://www.patricbrc.org/),利用CGEVirulenceFinder在线数据库对血清分型、MLST分型和毒力基因进行分析。
将提取的CMCC44841基因组DNA定量后,分别进行10倍梯度稀释,得到10-1、10-2、10-3、10-4系列浓度,参照GB4789.6-2016中引物序列和PCR检测方法,进行astA、aggR、pic特征性基因PCR扩增和灵敏度检测,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
取CMCC44841一代新鲜培养物,划线接种于TSA平板,36℃培养24h。用无菌棉签从平板上刮取菌落,加入到含有海藻糖和胎牛血清的冻干保护剂中,涡旋混匀,用移液枪吸取20μL在低温下速冻成球,然后于冷冻干燥机中冷冻干燥。将冻干后的菌球置于2mL的西林瓶中,利用冷冻干燥机进行真空压盖密封。最终制备成EAEC含量为103CFU/样品的菌球。
将纯度A260/A280为1.7的20µgDNA加入到20ml含有葡聚糖的冻干保护剂中,用移液枪吸取20μL在低温下速冻成球,然后于冷冻干燥机中进行冷冻干燥,最终制备成含量为20ng/样品的菌球。将冻干后的菌球放入2mL的西林瓶中,将胶塞虚掩的盖在西林瓶上,然后用冷冻干燥机进行真空压盖。
根据标准物质均匀性研究抽取样品数量要求,从制备的一批600瓶标准物质中随机抽取20瓶样品,每瓶样品充分溶于1mL生理盐水,使用螺旋涂布仪E50模式在TSA平板上进行螺旋涂布,每个样品2个平行。36℃培养24h后对平板进行菌落计数。根据CNAS-GL003对计数结果进行单因子方差分析,评价样品的均匀性。
根据标准物质均匀性研究抽取样品数量要求,从制备的一批300瓶标准物质中随机抽取10件样品,向每瓶标准物质样品加入100μLddH2O,充分溶解,制备成20ng/100μL浓度的DNA样品,取2μL作为模板,参照GB4789.6-2016中引物序列和PCR检测方法,进行astA、aggR、pic特征性基因PCR扩增。
将制备的EAEC菌体标准物质和gDNA标准物质分别存放于25℃和37℃条件下,EAEC菌体标准物质模拟实验周期为7天,分别于1、3、5、7天抽取3个样品,进行含菌量测定。根据CNAS-GL003中|-|≤0.3σ准则对结果进行稳定性评价。EAECgDNA标准物质模拟实验周期为14天,分别于1、3、5、7、14天抽取3个样品,对特征性基因进行PCR扩增,考察样品的运输稳定性。
将制备的EAEC菌体标准物质及gDNA标准物质分别于-20℃、4℃条件下保存2个月。于4℃保存7、14和28天,-20℃保存28和60天,分别抽取3个样品进行菌含量测定,于4℃和-20℃保存28、45和60天分别抽取3个样品进行特征性基因检测,考察样品的储藏稳定性。根据CNAS-GL003中|-|≤0.3σ准则对EAEC标准物质进行稳定性评价。
使用上述制备好的样品,按照国家药品标准物质协作标定实施细则,发给3家实验室,代码分别为A、B和C,每家实验室收到10件样品,参照协作验证作业指导书对样品中EAEC标准物质及其gDNA标准物质进行检验,包括菌落计数和特征性基因检测。
根据GB29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》,选择熟肉制品、乳粉、腐乳、饼干和薯片5种食品基质共20份样品对EAEC标准物质的使用效果进行验证,样品信息见表1。先将EAEC103CFU浓度的标准物质溶于1mL生理盐水中,每件样品各称取2份,25g/份,一份正常检验,一份加入标准物质100μL,根据GB4789.6-2016进行操作。增菌后划线分离平板观察是否有典型菌落生长,并进行PCR确认。