香菇富含多种营养（包括维生素、蛋白质、脂肪酸、氨基酸、矿物质元素），同时具有宜人的香气，食之味道鲜嫩，口感绝佳，食用价值较高。香菇又被称为冬菇或香蕈，在分类学中属于担子菌纲，伞菌目，口蘑科，香菇属，是一种为人们所喜爱的常见食用菌。中国是香菇消费和生产的大国，并且中国的香菇栽培规模也位列于世界的前端，然而在香菇的育种研究方面却有些许落后。所以，当务之急是香菇新品种研发以及原有品种的改良工作。

目前较为常用的育种手段是原生质体技术，这一技术能够在一定程度上有效缩短食用菌的育种周期，但是，此项技术还未在全国范围内进行推广实施，目前由原生质体技术所派生出的育种技术主要有以下4类，原生质体诱变、原生质体转化、原生质体融合、原生质体单核化。相对于其他育种方式而言，原生质体育种具有育种周期短、效率高的特点，同时对于食用菌的品质、产量以及抗性都有显著的提升效果，进而提高香菇的育种水平。这个过程里面原生质体育种的基础是原生质体的制备和再生。所以，本文重点研究外部环境条件对于香菇原生质体产量与再生率的影响，以此作为食用菌类的原生质体育种工作的参照。

1　材料与方法

1.1　供试材料

供试食用菌种：香菇（Letinula Edodes）辽抚4号编号0912，由抚顺市农业科学研究院提供；母种培养基（克/升）：马铃薯200.0、蔗糖10.0、葡萄糖10.0、蛋白胨2.0、木屑150.0（煎汁过滤）、硫酸0.5、磷酸二氢钾1.0、水1000.0、琼脂粉12.0，培养基的酸碱度调整至5.5；再生培养基：与母种相同，外加稳渗剂进行定容。

稳渗剂配置：甘露醇、0.4摩尔/升的硫酸镁、氯化钠、氯化钾，pH=5的蔗糖和葡萄糖液体。其他试验试剂：0.22微米微孔滤膜过滤除菌，该试剂需要现配现用，酶液用对应稳渗剂配制酶浓度（W/V，重量体积比）1.0%的蜗牛酶，纤维素酶与混合酶（蜗牛酶∶纤维素酶=1∶1）。Cellulase（MP Biomedical）及Snailase（Wolsen）等为国产分析纯。

1.2　试验方法

原生质体数量统计：利用血球板进行计数，首先将原生质体稀释至108，涂至平板上，然后按照公式：原生质体产量（个/毫升）=每格平均原生质体数×400×稀释倍数×104进行计算。原生质体再生率（%）=[(再生平板菌落数-CK板菌落数）×稀释倍数]/（涂布体积×原生质体浓度）×100方案设计：选取7个外部环境因素，考察这7个外部环境因素对香菇原生质体的产量以及再生率的具体影响。详情见表1。

2 结果与分析

2.1　不同种类裂解酶原生

质体产量与再生率的影响如图1所示，混合酶的酶解效果要比单一酶所产生的酶解效果好一些，混合酶作为酶解介质时，单位时间内原生质体的产量最高能达5.69×108个/毫升，此产量是蜗牛酶作为酶解介质原生质体产量的1.42倍，是纤维素酶作为酶解介质产量的4.15倍；混合酶作为酶解介质时，原生质体再生率是0.91%，蜗牛酶作为酶解介质的原生质体再生率为0.9%，达到了纤维素酶作为酶解介质时原生质体再生率的2.39倍。产生如此大差异的原因是，香菇自身的菌丝细胞壁组成成分比较复杂，因此，需要不同种类的酶共同作用，才能对其产生较好的降解作用。在此组试验中，蜗牛酶是包含了淀粉酶、蛋白酶等20多种不同种类的酶于一体。因此，其酶解效果与混合酶一样能够较好的刺激原生质体的再生，但是纤维素酶成分比较单一，故而对原生质体的酶解效果一般。综上研究，在后续的多因素试验中会优先选择混合酶作为介质。

2.2　酶解时间对原生质体产量与再生率的影响

通过图2可以看出，酶解时间在3小时之内时，原生质体再生率与时间呈正相关的关系，随着时间的增加，原生质体的产量也不断增加。之后，原生质体的再生率则会出现下降。在整个酶解过程中原生质体产量从2小时后明显上升，2.5小时后逐渐下降。回归分后，可知酶解时间为2.82小时，原生质体再生率达到顶点1.7%；酶解时间为3.44小时，原生质体产量达到最高2.27×108个/毫升。

2.3　酶解温度对原生质体产量与再生率的影响

原生质体的产量及再生率受温度影响效果明显，其中30℃是原生质体产量变化的临界点，在这之前原生质体产量醉着温度升高而增加，之后则出现明显的下降。经过回归方程计算可以得出，原生质体再生率在30℃达到最高，为1.08%，原生质体产量在29℃达到最高，为4.06×108个/毫升。分析其他酶解介质可以得出，蜗牛酶的最适酶解温度范围是30～37℃，纤维酶的最适酶解温度为35℃左右，当温度处于最适酶解温度时，其对于菌丝体细胞壁的酶解效果最好。因此，菌丝的细胞壁分解效率较高。而对于混合酶来说，虽然在35℃时酶活性较高，但是较高的温度会扰乱菌丝的内部代谢，影响细胞体内部稳定性，最终影响原生质体的产生。因此，当温度高于30℃，原生质体的再生率和产量均出现了明显下降。