2.4 PCI2细胞中的ROS水平及MDA含量

ROS主要来源于损伤的线粒体，当细胞内产生过量的ROS或体内氧化剂含量超过细胞的抗氧化应答能力时，细胞就会产生氧化应激。本试验以DCFH-DA作为荧光探针，检测2’，7’-二氯荧光素(DCF)的荧光强度即可获知细胞内ROS的水平。与空白对照组相比，90μmol/LH202处理PCI2细胞4h后，细胞内ROS水平显著增加(P＜0.01)，达到460.43％(图4a)，使细胞产生严重的氧化损伤；经脂溶性提取物预处理后，能够显著地抑制PCI2细胞内ROS的产生(P＜0.01)，其中2mg/L脂溶性提取物预处理细胞8h后，ROS含量为208.37％。荧光显微镜观察染色后的PCI2细胞发现，细胞呈现的荧光强度变化与细胞内ROS水平变化趋势一致(图4b)。因此，脂溶性提取物可以有效地清除ROS，缓解H202引发的线粒体功能障碍。
 

当动物或植物体产生氧化应激时，会发生脂质氧化，而MDA是一种生物体脂质氧化的天然产物，可以用来确定脂质氧化水平。与空白对照组相比，90μmol/LH₂0₂处理PCI2细胞4h后，MDA含量显著增多(P＜0.01)，达到192.98％(图5)；经脂溶性提取物预处理8h后，能够显著地阻止MDA的产生(P＜0.01)；而正常细胞经脂溶性提取物处理后，在无H₂0₂伤害的情况下，其MDA含量可降低至25.71％。

2.5 脂溶性提取物对PCI2细胞凋亡的影响

为了进一步探究脂溶性提取物能否有效地抑制细胞凋亡，利用AnnexinV-FITC/PI进行染色，经流式细胞术检测细胞凋亡率(图6a)。如图6b所示，与空白对照组(8.14％)相比，H₂0₂处理显著增加了细胞凋亡率(23.66％)，经朝鲜蓟脂溶性提取物预处理后，PCI2细胞的凋亡得到显著抑制。其中，经过2mg/L脂溶性提取物预保护后，细胞凋亡率降低至8.75％。

为了更加直观地比较不同处理组的细胞凋亡情况，利用A0-EB对细胞进行染色，通过荧光显微镜观察细胞形态。如图6c所示，空白对照组的细胞因为吖啶橙(A0)透过其完整的细胞膜嵌入DNA，几乎全部呈现绿色荧光，细胞形态正常。没有明显的凋亡相关形态学改变；经H202处理的模型组的细胞发生了边缘化、核凝集等发绿色荧光的早期凋亡现象，并且因为溴化乙锭(EB)透过其破损的细胞膜嵌入DNA，呈现出橘黄色荧光的晚期凋亡现象：而经过朝鲜蓟脂溶性提取物预处理的PCI2细胞呈现出早期凋亡和晚期凋亡细胞皆有减少的现象，并呈现质量浓度依赖性。

3 结论

本试验探究了朝鲜蓟副产物中脂溶性提取物对PCI2神经细胞的保护作用。利用GC-MS对朝鲜蓟副产物中萜类及甾醇类化合物进行定性与定量分析，结果表明，主要含有3种倍半萜内脂，2种甾醇及8种五环三萜。试验以H202作为氧化损伤诱导剂，探究朝鲜蓟副产物脂溶性提取物的生理活性，发现该提取物可降低PCI2神经细胞的氧化损伤，并且伴随细胞内LDH漏出率、MDA含量及ROS水平的降低。经过AnnexinV-FITC/PI双染及A0-EB双染后发现，经脂溶性提取物处理的PCI2细胞凋亡率显著降低，与荧光显微镜的观察结果一致。综上，朝鲜蓟副产物脂溶性提取物对PCI2神经细胞具有抗凋亡及保护作用，值得进一步的开发利用与研究。