目的

建立铁甲草中大黄素和齐墩果酸的含量测定方法。

方法

采用HPC法测定铁甲草中齐墩果酸的含量。WatersXBridgePeptideBEHC18（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇-PBS（85∶15），流速1.0mL/min，柱温35℃，进样量为10μL，检测波长210nm，测定齐墩果酸的含量。结果：齐墩果酸在5～50μg/mL的浓度范内呈良好线性关系（Y=4533X+909.6，R=0.9996），平均回收率为99.39%，RSD为1.53%（n=6）。

结论

本实验方法准确灵敏、稳定可靠，可用于铁甲草中齐墩果酸的含量测定。

铁甲草（CassiamimosoidesLinn.）为豆科（Leguminousae）决明属一年或多年生亚灌木状草本植物，以全草入药，主要分布于广东、福建、云南、台湾、贵州和广西等地，其味甘、性平，具有清肝明目、散瘀化积的功效。有研究结果表明，铁甲草能够有效抑制脂肪酶，防止脂肪肝；其主要化学成分有大黄素、齐墩果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素等。然而，目前国内外对铁甲草的研究主要集中在化学成分和药理作用方面，有关铁甲草药材质量控制的研究很少，且未见对其有效成分进行含量测定的报道。本实验以铁甲草中具有抗炎保肝的有效成分齐墩果酸，作为定量检测指标成分，建立铁甲草中齐墩果酸的HPLC含量测定方法，为铁甲草的质量控制和合理开发提供参考依据。

1仪器与材料

WatersAlliance2695型高效液相色谱仪；WatersXBridgePeptideBEHC18（4.6mm×250mm，5μm）；WJX-A1000型高速多功能粉碎机；JP-100S型超声波清洗器；MING-CHE24UV超纯水机。

齐墩果酸对照品（C1723001）；铁甲草采于广东省梅州市蕉岭县，经嘉应学院医学院生药学翟明老师鉴定为豆科决明属植物铁甲草（Cassiamimosoides）的全草；其他试剂均为分析纯。

2方法及结果

2.1对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品1mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

2.2供试品溶液的制备

称取铁甲草粗粉2g，加入2moL/L的盐酸10mL，充分浸润后，在60℃水浴下，酸水解2h，滤渣用超纯水水洗至中性，干燥后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液，调节pH值至8，50℃超声30min，抽滤后，水浴加热浓缩成浸膏。

浸膏用甲醇超声溶解后，离心取上清液，定容至10mL，即得。

2.3色谱条件

色谱柱：WatersXBridgePeptideBEHC18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇：PBS=85∶15；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL，柱温：35℃。

2.4线性关系考察

分别精密吸取“2.1”项下的齐墩果酸对照品0.5、1、2、3、4、5mL溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为5、10、20、30、40、50μg/mL系列浓度的齐墩果酸对照品溶液，于“2.3”项下的色谱条件，以齐墩果酸对照品溶液色谱峰面积Y为纵坐标，齐墩果酸对照品浓度X（μg/mL）为横坐标，进行线性拟合，得齐墩果酸标准曲线，求得回归方程Y=4533X+909.6，R=0.9996。结果表明，在5～50μg/mL的浓度范围内，齐墩果酸对照品溶液的峰面积与浓度的线性关系良好。

2.5专属性考察

取项目“2.1”和“2.2”项所制备的对照品溶液和供试品溶液，在“2.3”的色谱条件下进样，齐墩果酸的保留时间约为13.77min，峰型稳定，分离度良好，有较好的基线分离，未见杂质峰干扰，具有良好的专属性。如图1所示。

2.6仪器精密度试验

精密吸取对照品溶液1.0mL，于“2.3”项的色谱条件下，连续重复进样6次，每次10μL，检测得到大黄素峰面积的RSD为1.36%，表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

精密吸取供试品溶液1.0mL，分别于0、2、4、6、8、12h于“2.3”项色谱条件下进样，检测得到齐墩果酸的峰面积的RSD为0.82%。表明供试品溶液在12h内稳定。

2.8重复性试验

精密称取6份等质量铁甲草粗粉2.00g，按“2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，于“2.3”项的色谱条件，检测得到齐墩果酸峰面积的RSD为1.47%。表明该方法重复性良好。

2.9加样回收率试验

精密称取已知含量的等质量铁甲草粗粉6份，每份2.00g，分别精密加入同一浓度的齐墩果酸对照品，按上述“2.2”的提取方法平行制备成供试品溶液，于“2.3”项色谱条件下测定，计算得到平均回收率结果为99.39%，RSD为1.53%。表明该方法测得的结果有良好准确性。结果见表1。

2.10样品含量测定

精密称取3份不同批药材各2.00g，按照“2.2”项的制备方法制备成供试品溶液，每份样品分别在“2.3”项的色谱条件下进样三次，记录峰面积，计算样品中齐墩果酸的含量。结果见表2。

3讨论

在考察齐墩果酸的色谱条件时，曾采用甲醇水，甲醇-0.1%甲酸和甲醇-PBS作为流动相，考察结果显示，当流动相选择为甲醇-PBS（85∶15）时，样品中齐墩果酸分离度更好，峰型稳定，无杂峰干扰。由于齐墩果酸同时含有羟基和羧基基团，在碱性条件下更易被提取，在提取条件的考察过程中，发现加入适量碱溶液使其pH值至8时，更利于齐墩果酸成分的提取。

本实验建立应用高效液相色谱法测定铁甲草中齐墩果酸含量的方法，方法精密度高、稳定性、重复性、加样回收率均符合方法学验证的要求。测得3批样品中，齐墩果酸的含量在3.67%～3.73%之间，含量较高，且齐墩果酸在临床上主要用于护肝降酶，与铁甲草的功效相符，说明齐墩果酸适合作为铁甲草的质量检测指标成分，该方法可作为铁甲草质量控制的方法，从而为铁甲草质量标准的制订提供参考依据。