木耳做为一种宝贵的传统式服用细菌，不但能为身体给予碳水化合物、蛋白、膳食纤维素等营养元素，还有着抗氧化性、抗癌、降血脂和避免心脑血管疾病等各种活力作用。木耳带有各种营养元素，在其中所含含糖量成份的功能科学研究相对普遍，尤其是在食品类和保健产品开发设计领域具备运用使用价值，如木耳饮品、木耳原浆、油类等。研究发现，木耳含糖量可以明显增强人体免疫能力，抑止小白鼠脾网织红细胞转换繁衍工作能力，提高其小胶质细胞吞食工作能力和当然杀伤力体细胞活力。肠道微生物是身体的关键新陈代谢“人体器官”，在消化、基础代谢和免疫反应等生命活动中充分发挥关键功效。伴随着对肠道微生物与人体健康研究的深层次，发觉一切正常生理学情况下身体肠菌处在平衡情况，当内环境破坏或遭受外部影响时，会造成 肠胃内有益菌混乱，对人体身心健康造成危害。比如，抗生素滥用会毁坏肠道微生物物种均衡，提升炎性病症风险性。益生菌粉根据代谢一系列抑菌化学物质（有机物、双氧水和病菌素等）减少肠内pH，提升短链脂肪酸（Shortchainfattyacid，SCFA）成分来降低病原菌活菌数。研究发现，含糖量能够增进肠胃优点菌繁衍和调整肠胃内分必物，进而促使肠胃内环境稳态和身体身心健康。

虽然木耳具备较高的食用价值和宽广的应用前景，可是其含糖量成份对肠道微生物的控制功效与体制仍不清楚。为了更好地明确木耳含糖量对肠菌转变的调节效用以及微生物作用，本科学研究运用小白鼠实体模型，剖析木耳胞外含糖量对小白鼠肠菌多元性、SCFA成分转变及血清蛋白细胞因子的危害，为木耳含糖量益生菌粉微生态制剂和新式营养食品的研发给予理论基础。

1原材料与方式

1.1原材料与实验试剂

木耳菌种（GenBank：KF297975.1，天津市科技学院生物技术与生物学试验室储存）。工业乙醇（剖析级）、葡萄糖水（剖析级）、硫酸（剖析级）、二甲苯（剖析级），天津市北方地区天医化学药品厂；三氯甲烷（剖析级）、异戊醇（剖析级）、二氯甲烷（色谱仪级），上海生工生物技术有限责任公司；甲酸、己酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸，上海源叶生物技术有限责任公司；三聚磷酸钠抗原修复液，上海市碧云天生物技术性有限责任公司；牛血清蛋白，北京索莱宝高新科技有限责任公司；GPR43抗原，圣克鲁斯生物科技（上海市）有限责任公司；FIＴC标识的莹光二抗，赛默飞世尔高新科技（我国）有限责任公司；酶联免疫吸咐（ELISA）检测试剂盒，上海市茁彩生物技术有限责任公司。

1.2动物实验

SPF级近交系CD-1雌鼠18只，休重（20±3）g，动物实验许可证编号：SCXK（京）2016-0006，购于北京市维通利华动物实验技术性有限责任公司。

1.3实验仪器

AB204-S型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器设备深圳公司；GH-6000型电加热恒温培养箱，天津泰斯特仪器设备有限责任公司；ALPHA2-4/LD型冷冻式干燥机，法国CHRIS企业；722型紫外线光度计，上海精科分析仪器公司；7890A气相色谱，英国安捷伦科技有限责任公司；BX53正置光学显微镜，日本Olympus企业。

1.4木耳胞外含糖量获取

木耳发醇塑造参考肖红霞的方式 。发酵物经3000r/min离心式20min弃沉积，上清液立即开展真空蒸发，浓缩至原容积的1/4，添加工业乙醇（摩尔分数30%），4℃留宿。3000r/min离心式20min后，往上清水溶液添加去蛋白质实验试剂（三氯甲烷异戊醇=1∶4）并磁力搅拌10min，3500r/min离心式15min弃沉积，上清液添加工业乙醇（摩尔分数75%）4℃留宿。4000r/min离心式15min获得沉淀即是粗多糖，将含糖量沉积自来水复溶后分析12h，每2h换1次水，接着低温干燥，获得木耳胞外含糖量。

1.5含糖量的评定及单糖构成剖析

1.5.1含糖量的红外光谱分析分析

称量木耳胞外含糖量1mg，添加适量溴化钾（KBr）粉末状于研钵中，充足碾磨后碾成全透明片状，接着用NicoletIS10FＴIR光谱分析仪（ＴhermoScientific，英国）在400～4000cm-1峰位范畴内扫描仪，纪录IR光谱仪。

1.5.2含糖量的单糖构成剖析

本实验运用高效率液相色谱，融合PMP（1-苯基-3-羟基-5吡唑啉酮）柱前衍化画法对木耳胞外含糖量试品做好了单糖构成剖析。含糖量的溶解和衍化化方式参考王媛媛等科学研究。高效液相色谱检验标准以下：C18色谱柱；流动性相为0.1mol/LpH6.5硫酸铵缓存盐∶乙腈（V/V）=85∶15；流动速度1mL/min；柱温40℃；检验光波长250nm；进样量20μL。

1.6小动物实验

1.6.1动物实验排序及解决

将选购的18只身心健康CD-1雌虫小白鼠喂养在20～22℃、45%～55%RH的无菌检测清洁自然环境中，让其随意进餐（市面上一般精饲料），适应能力饲养7d。将其任意分成2组（每一组9只）即实验对照实验（Control），木耳胞外含糖量组（Fermentation-exopolysaccharide，F-P）。将木耳胞外含糖量用盐水配备，随后依照1.5g·kg^-1BW^-1开展灌胃解决（每只小白鼠每一次给药容积为0.2mL），持续灌胃21d；对照实验给与等大小的盐水解决。

1.6.2小白鼠休重及内脏器官指数

实验期内每7d纪录1次小白鼠休重，将2组休重均值做变化趋势。第二十一天，脱位法处决小白鼠后，迅速分离出来肝、脾、心、肺、肾等内脏器官，内脏器官用吸水海绵吸走后，开展称重和数据收集，最终对内脏器官指数及稳定性开展评定。

内脏器官指数=（内脏器官品质/休重）×100%。

1.6.3小白鼠肠菌剖析评定

灌胃实验完成后（第二十一天），无菌检测收集新鮮排泄物0.1g，放进杀菌管，将被测试品交派森诺生物技术有限责任公司开展有益菌评定剖析。步骤以下：最先获取试品病菌总DNA，随后以微生物菌种核糖体RNA总体目标编码序列为靶标，设计方案16SrRNAＶ3-Ｖ4区的非特异引物设计，等温扩增搭建百度文库。搭建好的百度文库经梯度方向稀释液，运用IlluminaMiSeq转录组测序服务平台转录组测序。转录组测序結果根据生物信息学方式开展亚基因剖析和肠道微生物两栖纲剖析。

1.6.4小白鼠排泄物中SCFAs成分剖析

低温干燥排泄物试品，精确称量50mg试品，添加1.2mL聚磷酸盐缓冲溶液（pH7.3）搅拌，4℃14000r/min离心式20min，汲取上清液至5mL离心管架中。每200μL上清添加0.1mL的稀释液后盐酸（摩尔分数50%），充足搅拌3min，用2mL二氯甲烷（色谱仪级）开展提纯，4℃静放2h，随后用0.22μm有机滤膜过虑。选用气象色谱仪（GC）检验试样中短链脂肪酸的成分，试品获取方式参考Zhao等并做一部分改动。GC剖析选用基本HP-FFAP（25m×0.32mm，0.5μm）配备柱，程序流程设置参考贾益群等在微生物试品油酸获取与解析的分析結果，并更改其分离之比20∶1。SCFA标准物质水溶液的配制及其标曲制作参考孟拓等对气象色谱仪-质谱分析联用分析法肠道炎小白鼠短链脂肪酸新陈代谢科学研究結果。

1.6.5小白鼠乙状结肠GPR43检验

小白鼠灌胃21d后，脱位法处决小白鼠迅速分离出来肠胃交武汉市谷歌生物高新科技有限责任公司制做石蜡切片。取乙状结肠石蜡切片用二甲苯脱腊解决，经不一样浓度梯度酒精开展凝固解决后用三聚磷酸钠抗原修复液95℃温育15min开展抗原修复，并将其降温到室内温度，经3%BSA室内温度封闭式解决30min完用GPR43抗原4℃孵育12h，以后用FIＴC标识的莹光二抗室内温度遮光孵育1.5h，再用DAPI室内温度遮光孵育30min，执行封片并留宿吹干，于暗室标准下开展光学显微镜观查。

1.6.6小白鼠血清蛋白细胞因子测量

小白鼠灌胃21d后，根据摘目光采血，并将血夜储存在带有乙二胺四乙酸络合剂（EDＴA）的搜集管内，4℃储放3h。待当然沉淀后，用无菌检测枪嘴汲取血清蛋白，运用酶联免疫法（ELISA）测量小白鼠血清蛋白中IL-6、IL-10和ＴNF-α的成分。实验流程参考上海市茁彩生物技术有限责任公司ELISA检测试剂盒实际操作使用说明。

1.7应用统计学剖析

实验結果选用Graphpad5.0分析手机软件数据分析，t检验剖析每组间显著性差异，数据信息以x-±s表明，当P＜0.05时，觉得具备显著性差异。