水豆豉是以黄豆为原材料，由枯草芽孢菌、小量乳酸菌饮料及酵母等微生物菌种当然发醇得到的中华传统发醇豆类食品。水豆豉含有各种营养元素，具备不确定性的降血脂、降低血脂、抗氧化性等工作能力，商品豉香浓厚，口味与众不同，备受顾客的钟爱。水豆豉与日本纳豆激酶同是病菌型水豆豉的意味着，二者在原材料、菌种、加工工艺等领域比较类似，纳豆激酶有较强的溶血栓活力，被普遍科学研究并做为改进静脉血栓类疾患的功能性食品而世界闻名。纳豆激酶及一部分水豆豉具备的溶血栓活力关键来自于发醇全过程中微生物菌种成长新陈代谢生产的纤溶酶类化合物。普遍的产纤溶酶菌种主要是枯草枯草芽孢菌。尽管解木薯淀粉枯草芽孢菌也具备产纤溶酶的工作能力，可是科学研究较多的是产酶标准提升及酶学特点等，并未见用其非纯种发醇制取具备溶血栓活力的水豆豉的报导。

现阶段，世界各国有关水豆豉的分析较少，且多聚集于商品辅材配制和不一样生产流程对商品特性的危害，对水豆豉的活力化学成分及作用的探究开始比较晚。尹爽等科学研究不一样加工工艺标准下水豆豉曲的氨基酸态氮、水份、总酸等化学成分的变动状况，并对添加的辅材使用量开展可靠性设计。刘佳慧等科学研究了酒曲制作溫度、载货量、酒曲制作時间、细胞生长因子加上量等对水豆豉曲氨基酸态氮成分的危害。冯霞等根据身体之外抗氧化性实验及临床实验发觉玻璃器皿发醇的水豆豉比瓷器和塑料制品发醇的水豆豉有更强的抗氧化性实际效果。庞庆芳等发觉不一样生物发酵的水豆豉中病菌型水豆豉的溶血栓活力差别明显，在其中，当然发醇水豆豉的溶血栓活力较低，非纯种发醇很有可能会增强企业产品的溶血栓活力。

本研究组初期从水豆豉试品中挑选到1株产纤溶酶的解木薯淀粉枯草芽孢菌CAUnDJ118。文中用该菌种发醇大豆类食品原材料（大豆、大黑豆、双青豌豆）制取3种水豆豉，并分析其营养元素、溶血栓及抗氧化性活力，为进一步开发设计能改进心脑血管疾病的水豆豉功能性食品给予实验数据信息。

1 原材料与方式

1. 1原材料与实验试剂

1.1.1 原材料

解木薯淀粉枯草芽孢菌CAUnDJ118，中国农大食品科学与养分工程学校酶工程试验室挑选并储藏；大豆、大黑豆、双青豌豆，产于黑龙江齐齐哈尔市；辣椒面、生姜粉、食用盐，购于北京美廉美超市学清路店。

1.1.2 实验试剂

凝血酶、纤维蛋白、Gly-Leu、DPPH、ABTS、Trolox、TPTZ，英国SIgma企业；胰蛋白胨、酵母提取物，美国OxoId企业；芦丁，上海源叶生物技术有限责任公司；没食子酸，上海市麦克林企业；肝素钠，北京市拜尔迪企业；其他实验试剂无尤其表明均为国内分析纯级。

1.2 机器设备与仪器设备

全温振荡培养箱（HZQ-F160），太仓市豪城实验室仪器生产制造有限责任公司；立柱式工作压力蒸汽灭菌锅（TYAIB），宁波市久兴医疗机械有限责任公司；恒温水浴锅（DK-S24），上海精宏实验仪器有限责任公司；紫外线由此可见光度计（TU-1800PC），北京市普析通用实验仪器有限责任公司企业；酶标仪（ThermoMulTISkanFC），英国ThermoFISherSCIenTIFIC企业。

1.3 方式

1.3. 1种籽液塑造

将解木薯淀粉枯草芽孢菌CAUnDJ118在固体培养基上活性后，挑菌1环连接液态种籽培养液（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%naCl，pH7.2～7.5），在37℃，200r/min下塑造10h上下，当菌体数在109CFU/mL时做为种籽液。

1.3.2 水豆豉的加工工艺病菌型水豆豉的制造生产流程如下所示：

大豆、双青豌豆、大黑豆→挑选→泡浸→蒸制→注射→前酵→后熟→拌料→后酵→制成品

采用颗粒物圆润、尺寸匀称、无病虫害发霉的大豆、双青豌豆、大黑豆原材料各100g，添加300mL纯净水于常温下泡浸18h，泡浸后各种湿豆品质约250g（湿豆品质为湿豆品质的2.4～2.5倍为宜）。将泡浸完毕后的黄豆沥水、散装（直徑25Cm的夹层玻璃培养皿上装200g湿豆原材料），121℃蒸制杀菌20mIn，制冷后连接湿豆品质5%的解木薯淀粉枯草芽孢菌CAUnDJ118种籽液，于37℃塑造24h，随后放置4℃后熟1d。将杀菌制冷后的调味品水（含5%食用盐、3%辣椒面、3%生姜粉）按湿豆品质50%的增加量添加后熟进行的水豆豉中，于45℃后发醇1d，得到水豆豉制成品。

未发醇水豆豉除在注射时将种籽液换成相等无菌水外，其他加工工艺与发醇水豆豉同样。

1.3.3 试品解决及获取方式

将水豆豉制成品放进真空泵冷冻式干燥机中，低温干燥48～60h，破碎过20目筛得到水豆豉干冻粉试品，密封性存放于-20℃，预留。试品待测液的配制方式以下：

水豆豉干冻粉水提液制取方式：称量5.0g水豆豉干冻粉试品，添加50mL纯净水，25℃，200r/mIn摇床萃取法2h，10000r/mIn离心式10mIn，搜集上清液，得到水豆豉试品水提液。水提液中折算水豆豉试品干冻粉成分为100mg/mL。
水豆豉干冻粉醇提液制取方式：称量5.0g水豆豉干冻粉试品，添加15mL摩尔分数80%工业甲醇，以480W输出功率超声波解决20mIn后，4000r/mIn离心式10mIn得到上清液。反复3次，合拼上清液并将萃取液容积滴定剂50mL，得到水豆豉试品醇提液。醇提液中折算水豆豉干冻粉成分为100mg/mL。

1.4 活力测定法

1.4.1 纤溶活力的测量

将1.4mL50mmol硼酸缓冲溶液、0.4mL0.72%纤维蛋白水溶液搅拌后于37℃恒温水浴锅中加热5mIn，添加0.1mL20U/mL凝血酶，搅拌，在37℃下反映10mIn待其凝结。将水豆豉干冻粉水提液（100mg/mL）稀释液5倍，在化学反应系统中添加0.1mL水豆豉干冻粉水提液封闭液（20mg/mL），搅拌后于37℃下反映60mIn，每过20mIn震荡搅拌1次。反映完成时马上添加500μL0.2mol三氯乙酸水溶液（TCA）停止反映，10000r/min离心式10mIn，取上清液在275nm处测量吸光度值。阴性对照的解决为本加终止剂TCA水溶液，后加试品封闭液。酶活的界定：在以上情况下，与参考对比，测量时常用试品封闭液的吸光度值每分提升0.01等同于一个酶活企业，企业为FU/mL。依据水豆豉干冻粉水提液中折算水豆豉干冻粉品质，将結果计算为FU/g。计算方法如下所示：

式中，x—试品溶剂的纤溶酶魅力，FU/mL；A_r—试品的吸光度值；A_C—阴性对照的吸光度值；60—反应速度60mIn，以1mIn计；0.1—反映的酶液态积是0.1mL；N—稀释倍数。

1.4.2 抗凝血活力的测量

参照刘梦洁等的办法并稍加调节。纤维蛋白、凝血酶均用凝血酶均用50mmolpH7.2的TrIS-HCl缓冲溶液（含0.12mmolnaCl）稀释液融解。将水豆豉干冻粉水提液（100mg/mL）先后稀释液10，20，40，80，160，320，640倍得到不一样含量的水豆豉干冻粉水提液封闭液。在96孔板中添加140μL0.1%纤维蛋白、40μL不一样含量的水豆豉干冻粉水提液封闭液，置酶标仪中，在405nm处测量吸光度值。5mIn后添加10μL12U/mL凝血酶，37℃反映10min后在405nm处测量吸光度值。阳性对照为相等10mg/mL肝素钠替代试品。空白试验为相等TrIS-HCl缓冲溶液替代试品。试品的抗凝血活力按住式测算，依据试品浓度值与抗凝血活力的关联测算试品的抗凝血活力IC₅₀值。

式中，x—某浓度值试品待测液的抗凝血活力百分数，%；A_c10min—反映10mIn后空白试验的OD值；A_c5min—加热5min后空白试验的OD值；A_s10min—反映10mIn后试品待测液的OD值；A_s10min—加热5mIn后试品待测液的OD值。

1.4.3 活性多肽成分的测量

选用邻苯二甲醛测定方法水豆豉的活性多肽成分，待测液为稀释液20倍的水豆豉干冻粉水提液（5mg/mL），用Gly-Leu二肽做为标准物质制做标曲，企业为mg/mL，随后依据水豆豉干冻粉品质，将結果计算为mg/g。

1.4.4 氨基酸态氮成分的测量

将一部分未干冻解决的水豆豉试品搅拌均匀后放进研钵中，在10mIn内快速碾磨至无人眼由此可见颗粒物，装进磨口瓶中预留。用已经知道品质的称量瓶称量搅拌均匀的水豆豉试品5.0g，用50mL80℃的纯净水分多次洗入100mL量杯中，制冷后转到100mL容量瓶中，用小量水份次清洗量杯，将洗剂划入容量瓶中滴定剂100mL，搅拌后过虑得到水豆豉待测液。依照国家行业标准《食品中氨基酸态氮的测定》GB5009.235-2016酸度计测定方法水豆豉的氨基酸态氮成分，企业为g/100g。

1.4.5 总酚成分的测量

选用福林（FolIn）-酚试剂测定方法水豆豉的总酚成分，将水豆豉干冻粉醇提液（100mg/mL）稀释液10倍后作待测液，以没食子酸做为标准物质制作标曲，企业为mgGAE/mL，依据水豆豉干冻粉品质将結果计算为mgGAE/g。

1.4.6 总大豆异黄酮成分的测量

参照Herald等的办法测量水豆豉的总大豆异黄酮成分，将水豆豉干冻粉醇提液（100mg/mL）稀释液10倍后作待测液，以芦丁为标准物质制做标曲，企业为mgRE/mL，依据水豆豉干冻粉品质将实验結果计算为mgRE/g。

1.4.7 抗氧化性活力的测量

参照DaI等和Gan等的办法测量水豆豉的DPPH氧自由基消除工作能力、ABTS氧自由基消除工作能力、FRAP复原工作能力。将水豆豉干冻粉醇提液（100mg/mL）各自稀释液适合倍率，获得不一样浓度值的封闭液，测量并测算不一样水豆豉干冻粉浓度值下的DPPH、ABTS清除率。

DPPH、ABTS清除率按住式测算，以Trolox做为标准物质制做标曲，依据水豆豉干冻粉品质，将结论用μmolTE/g表明。

水豆豉的FRAP复原工作能力测量以FeSO₄水溶液制做标曲，计算复原力，待测液的FRAP复原工作能力企业为μmolFe² /mL，依据待测液中折算水豆豉干冻粉品质开展计算，結果以μmolFe² /g表明。