β-甘露聚糖酶是一类可以水解反应以β-1，4-D-吡喃甘露糖为主导链的内切圆核糖核苷酸的统称，归属于木质素抗氧化物，普遍出现于大自然。微生物菌种是工业化生产甘露聚糖酶的具体来源于，真菌和细菌全是造成甘露聚糖酶的关键微生物菌种，在其中病菌是产β-甘露聚糖酶的最大的人群。甘露聚糖酶有普遍的使用使用价值，在食品工业、造纸工业、养殖业、石油开采以及它行业都是有辉煌的应用前景。近些年，伴随着在我国畜牧业养殖行业的迅速发展趋势，甘露聚糖酶做为第三代精饲料酶变成了科学研究的网络热点。

在饲料厂中加上β-甘露聚糖酶可推动营养元素的消化，减少生物的养分新陈代谢和养分耗费，提升精饲料转换率；改进肠道微生态自然环境，提高小动物免疫能力；推动性激素的代谢，加速成长速率；提高低品质精饲料的营养成分等。殊不知一般β-甘露聚糖酶的耐碱性较弱，无法在小动物胃肠自然环境下充分发挥，因而找寻具备耐碱性的β-甘露聚糖酶是根本所在。

本试验以耐碱性做为挑选指标值，从魔芋种植土壤层中筛分获得耐碱性的β-甘露聚糖酶的造成菌，对该菌的发醇情况开展基本提升，为后期科学研究带来基本。

一、原材料和方式

1、原材料

（1）试品来源于

土壤层试品收集自重庆奉节县黄国民党魔芋种植场。

（2）培养液(按质量浓度计)

聚集培养液：酵母菌浸粉0.5%、魔芋精粉1.5%、NaC10.5%、蛋白胨0.3%、pH7.2～7.4，115℃杀菌30min。

挑选培养液：NH4C10.5%、NaC10.5%、甘露聚糖1.0%、琼脂粉2.0%、pH7.2～7.4，115℃杀菌30min。

种籽培养液：魔芋精粉1.0%、蛋白胨0.5%、NaCl1.0%、当然pH，115℃杀菌30min。

原始发醇培养液：魔芋精粉2.0%、蛋白胨1.0%、NaCI1.0%、当然pH，115℃杀菌30min。

2、菌种挑选

土壤层预备处理后开展聚集塑造，用梯度方向稀释液法解决聚集细胞培养液并施胶在挑选培养液上，选择涨势较好且菌体直徑大的单菌体开展画线分离出来，提纯三次之上，斜坡4℃储存。

将分离纯化获得的菌种开展摇瓶发醇，发醇后离心式获得粗酶液。粗酶液用pH4、0.2mo/L磷酸氢二钠一柠檬酸钠缓冲溶液37℃、150r/min耐酸性解决1h，完用DNS测定方法粗酶液酶活，挑选酶魅力较大的菌种为供试菌。

3、酶魅力测量

取粗酶液0.1mL，加至0.9mL槐豆胶水溶液(0.5g槐豆胶 100mL、pH6.0、0.2mol/L磷酸缓冲液)试管婴儿中，55℃的水浴反映10min。在试管婴儿中添加lmLDNS实验试剂，开水浴5min消灭和着色，后水流制冷，滴定剂至10mL。以空缺液调零，在540nm处测其OD值。在甘露糖标曲(参照张闻的办法制取)上查出来相对应的甘露糖成分，测算甘露聚糖酶酶活。

酶魅力界定：1个酶魅力企业(U)为以pH6.0、0.5%槐豆胶为底物，在55℃水浴中反映10min，每1lmin造成等同于lumolD-甘露糖所须要的酶的量。

式中：Fg-由标曲查出来的甘露糖mg数、n-稀释倍数、0.1-酶液mL数、t-控温時间、180-甘露糖相对分子质量。

4、菌种评定

将挑选获得的菌种注射于LB液体培养基塑造8～12h，离心式搜集菌体。选用Ezup立柱式病菌基因DNA抽提检测试剂盒(生工生物工程项目股权有限责任公司)获取病菌总基因DNA。选用16SrDNA增加通用引物：

7F：CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA、27F：AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT，增加该菌种的16SrDNA。PCR反映管理体系：基因DNA(20～50ng/uL)0.5μL、10xBuffer(withMg2 )2.5L、dNTP(2.5mmol)1μL、酶0.2μL、F(10umol)0.5μL、R(10umol)0.5μL、加双纯净水至25μL。PCR循环系统标准：预转性：94C4min，转性：94℃45sec，淬火：55℃45sec，拓宽(30cycle)：72℃1min，修补拓宽：72℃10min，停止反映：4℃。将得到的PCR物质经1%琼脂糖电泳电泳原理，选用SanPrep立柱式DNA胶回收利用检测试剂盒(生工生物工程项目股权有限责任公司)回收利用PCR物质。将PCR获得的16SrDNA送往生工生物工程项目(上海市)股权有限责任公司开展转录组测序，获得转录组测序結果后进到NCBI网址，BLAST数据分析GenBank中原有的病菌16SrDNA，并应用MEGAX搭建该菌种的系统发育树开展开放阅读框剖析。

5、响应面BOX-Behnken试验设计

在单要素试验效果的根基上，对发醇培养液构成开展响应面提升。选择变量要素为A-魔芋精粉、B-酵母菌浸粉、C-Mn22 ，响应值(R1)为酶活。应用手机软件Design-Expert10.0.7对以上要素开展回应斜面多元回归分析，对发醇培养液的构成开展提升。BOX-Behnken实验要素水准表如表1：

二、結果与剖析

1、菌种的剥离与挑选

将聚集细胞培养液的封闭液施胶于挑选培养液，产甘露聚糖酶的菌种会在培养液上生长发育，为此来挑选菌种。选择涨势较好且菌体直徑大的10株单菌体进到复筛，并定名为NSG-1、NSG-2、……、NSG-10。

将挑选获得的10株菌开展摇瓶发醇，用DNS测定方法粗酶液酶魅力。

NSG-6在经耐碱性试验后酶魅力为1.78U/mL相对性最大，其一切正常酶魅力为2.05U/mL，故将其做为供试菌种。

加双纯净水至25μL。PCR循环系统标准：预转性：94℃4min，转性：94℃45sec，淬火：55℃45sec，拓宽(30cycle)：72℃1min，修补拓宽：72℃10min，停止反映：4℃。将得到的PCR物质经1%琼脂糖凝胶电泳，选用SanPrep立柱式DNA胶回收利用检测试剂盒(生工生物工程项目股权有限责任公司)回收利用PCR物质。将PCR获得的16SrDNA送往生工生物工程项目(上海市)股权有限责任公司开展转录组测序，获得转录组测序結果后进到NCBI网址，BLAST数据分析GenBank中原有的病菌16SrDNA，并应用MEGAX搭建该菌种的系统发育树开展开放阅读框剖析。