1.2.4油茶树提取液的配制及5α-R抑止活力的测量

1.2.4.1不一样芳烃油荼叶提取液的配制及提取率的测算

油荼叶除去变病历经选择，45℃烘干箱干躁，破碎过60目筛，称量8份20g油荼叶粉末状按1:40（w:v）料液比各自添加水、50%乙醇溶液、工业甲醇、酒精、正丁醇、乙酸丁酯、二氯甲烷、乙醚，先拌和泡浸3h再于50℃下超声波震荡获取2次（2h/次），4000r/min离心式10min促使固液分离设备，上清液转动挥发缓解压力浓缩去除有机化学实验试剂，随后真空泵低温干燥，获得不一样极性溶剂的油茶树粗提取液各自记作A1-~A8，观查其色泽及特性，并测算得率，计算方法如下所示：

得率%=100×m//M（4）

式中m为提取液的品质（g），M为原材料干基品质（g）。

1.2.4.2油荼叶提取液5α-R抑止活力的测量

各自取A1~A8干冻粉末，用50%酒精均配置成200μg/mL的封闭液，依照1.2.2测量A1-A8封闭液对5α-R的抑制率，以5α-R抑制率为指标值，明确最好制取有机溶剂，并测量、测算最好有机溶剂提取液对5α-R活力的半抑止浓度值（IC50），有关计算方法同公式计算（3）。

1.2.5油茶树提取液总酚和黄酮类物质成分的测量

用50%乙醇溶液将A1~A8配置成1mg/mL的封闭液，选用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸计，测量不一样油荼叶提取液中的总酚成分。标曲的制取：配置梯度方向浓度值的芦丁水溶液0~50μg/mL。在1mL管理体系中先后添加100μL没食子酸水溶液，250μL的福林酚试剂，250μL的15%的碳酸钠溶液，再补充400μL水至1mL终容积。充足搅拌以后80℃水浴置放30min，静放制冷10min，4000r/min离心式5min，取上清液于778nm测量吸光度值A778。根据没食子酸规范溶液的浓度和相对应的吸光度值制作标曲。试品的测量：实际操作跟上面一样，将试品吸光度值带到标曲，以没食子酸计，算得试品总酚成分。

选用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠溶液着色法，以芦丁计，测量不一样有机溶剂植物提取中黄酮类物质的成分。标曲的制取：高精密配置梯度方向浓度值的芦丁水溶液0~50μg/mL。汲取200μL被测芦丁水溶液，放置5mL试管婴儿中，添加300μL60%乙醇溶液，再添加100μL亚硝酸钠水溶液，混匀，置放6min，添加150μL硝酸铝水溶液，混匀，置放6min，添加400μL氢氧化钠溶液水溶液，最终添加1.35mL60%乙醇溶液至终管理体系为2.5mL，混匀，置放15min，于510nm测量吸光度值A510。根据芦丁规范溶液的浓度和相对应的吸光度值制作标曲。试品的测量：实际操作跟上面一样，将试品吸光度值带到标曲，以芦丁计，算得试品黄酮类物质成分。

1.2.6超高效率液相色谱仪串连三重四极杆航行時间质谱分析（UPLC-TRIPLETOF-MS/MS）剖析评定油荼叶提取液的有机化学成分

参照刘蕾的办法获得8mg油荼叶50%酒精提取液，添加2mL工业甲醇，配置成4mg/mL的提取液待测液，超声波5min完用0.22μm微孔滤膜过虑至高效液相瓶中，被测。

离子交换柱：C18柱（2.1mm×150mm,1.8μm）；流动性相：0.1%苯甲酸-溶液（流动性相A）和乙腈（流动性相B）；梯度方向过柱标准：0~10min，5%~13%B；10~20min，13%B；20~40min，13%~20%B；40~60min，20%~45%B；60~70min，45%~100%B；进样量：10µL；流动速度：1mL/min；柱温：35℃；检验光波长：280nm。

UPLC-TripleTOF5600 航行時间液质联用仪：空气负离子逐行扫描；扫描仪范畴：m/z100-2000；做雾化气（GS1）：55psi；做雾化气（GS2）：55psi；气帘气（CUR）：35psi；离子源溫度（TEM）：550℃（负）；离子源工作电压（IS）：-4500V（负）；一级扫描仪：去簇工作电压（DP）：100V；对焦工作电压（CE）：10V；二级扫描仪：应用TOFMS-ProductIon-IDA方式收集质谱分析数据信息，CID动能为20、40和60V，气相前，用CDS泵做品质轴校准，使品质轴偏差低于2ppm。

1.3数据处理方法

选用EXCEL手机软件开展数据统计分析（每组数据信息均用±s来表明）；用GraphpadPrism6.0制作曲线图、柱形图；相关分析选用SPSS中Pearson相关分析统计分析检测（*P＜0.05）。

2結果与探讨

2.15α-R粗酶提取液蛋白质成分

粗酶提取液展现淡粉色，选用Bradford法对5α-R粗酶提取液定量分析，以蛋白质含量表明。测得蛋白标曲为y=0.5753x 0.5269（y为吸光度值，x为规范蛋白质浓度值，R2=0.9977），算得浓度值为12.12mg/mL。

2.2T的标曲

如图2所显示，T在5μmol/L~2000μmol/L范畴内展现较好的线性相关，线性回归方程为y=18110x 116886（R²=0.9998）。

2.3酶促反应管理体系的明确

如图所示3所显示，在0~2mmol/L范畴内，伴随着NADPH浓度值的提升，酶促反应持续升高，当NADPH浓度值再提升时对酶促反应的危害并不大，并且充分考虑NADPH价格比较贵，故最后挑选2mmol/L做为NADPH在5α-R酶促反应管理体系中的适合加上浓度值。如图4所显示，在0.1~2mmoL范畴内，伴随着T浓度值的提升，酶促反应持续升高，挑选酶促反应最大时相匹配的2mmol/L做为T在5α-R酶促反应管理体系中的适合加上浓度值。如图所示5所显示，5α-R提取液浓度值在0.38~0.76mg/mL范畴时，伴随着提取液浓度值提升，酶魅力慢慢升高，在含量为0.76mg/mL时到达最大值，以后伴随着提取液浓度值的扩大酶魅力反倒减少，因而明确0.76mg/mL为5α-R提取液浓度值在5α-R酶促反应管理体系中的适合加上浓度值。

最后确认的反映标准以下：pH为7.4的聚磷酸盐缓冲溶液300μL，加上浓度值为0.76mg/mL的粗酶提取液500μL，加上浓度值为2mmol/L的T50μL，试品50μL,加上浓度值为2mmol/L的NADPH100μL，反映溫度为37℃，反应速度为30min。