Copines蛋白质大家族是一类Ca2 依靠不饱和脂肪酸融合蛋白质，遍布普遍且演变传统。该大家族组员结构类型具备同样特点:N尾端有两个与给定的Ca2 依靠不饱和脂肪酸融合C2结构域高宽比差不多的C2结构域;C尾端有1个与融合蛋白质(integrin)胞外区的A结构域具备开放阅读框的A结构域。现阶段在哺乳类动物中已发觉8个该蛋白质大家族组员，各自为Copine-1～Copine-8(遗传基因名CPNE1～CPNE8)。

Copine-1蛋白质是最早被发觉的。Yoo等根据小影响RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低Copine-1基因表达可以控制人骨肿瘤体细胞的繁衍、侵蚀和转移。研究发现，恶性肿瘤萎缩因素α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能够上涨内源Copine-1蛋白质的表述，且TNF-α数据信号传递方式对毒蕈碱刺激性的反映伴随着Copine-1表述的提高而提高;Copine-1蛋白质还能够提高核因素κB抑止蛋白质(inhibitor of nuclear factor kappa-B，ⅠκB)的TNF-α依赖感溶解。除此之外，Copine-1蛋白质与p65相互影响可以清除核因素κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)的基因表达。Copine-6蛋白质关键在神经细胞中表述，研究表明，Copine-6蛋白质在癫痫病脑部中的非常表述很有可能与难治性癫痫有主要联络。Copine-7蛋白质是一种成神经元细胞衍化因素，可以调整间充质干细胞美容的成牙釉质细胞增殖和正方向管控牙釉质唾沫磷蛋白质表述。Copine-8蛋白质可能是一个抑止亚急性髓性败血症肿瘤细胞繁衍的因素。

Copine-3蛋白质与Copine-1蛋白质的氨基酸序列开放阅读框达到63%，其在身体的脑、肺、心血管、肾脏功能机构中都有表述。Caudell等发觉，内源Copine-3蛋白质和外源性表述的资产重组Copine-3蛋白质均可使外源性髓鞘不饱和脂肪酸偏碱蛋白质磷酸化，殊不知，Copine-3蛋白质氨基酸序列中缺乏已经知道的蛋白激酶催化反应结构域，这种科学研究提醒，Copine-3蛋白质很有可能具备自身的蛋白激酶活力。研究发现，Copine-3蛋白质的高表述与亚急性脊髓性败血症的欠佳愈后相关。Tan等研究发现，与身患漫性冠脉疾患的病患对比，亚急性心肌梗塞病人的血细胞中Copine-3蛋白质的表述量更低，说明CPNE3遗传基因的低表述是产生亚急性心梗的潜在性风险源。总的来说，Copine-3蛋白质在人体细胞中普遍表述，但其在人体细胞中的作用尚不确立。

本科学研究运用加强型翠绿色荧光蛋白(plasmid enhanced green fluorescent protein,p EGFP)-N1搭建资产重组真核表达载体，脂质体转染人胚肾鳞状上皮细胞293T、肺癌体细胞H1299，瞬间表述Copine-3-EGFP融合蛋白，观查并检验Copine-3蛋白质在人体细胞中的精准定位，为进一步科学研究其分子生物学作用给予基本。

原材料和方式

1．关键实验试剂和仪器设备

DMEM培养液、10%胎牛血清(FBS)、OptiMEMTMⅠ培养液购自Gibco企业;107IU/L青霉素钠 10 g/L氨苄青霉素(法抗)、0.25%蛋白酶体细胞消化酶购自索莱宝高新科技有限责任公司;LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent转染实验试剂、Pro LongTM Gold Antifade Mountant with DAPI封片状、Copine-3抗原(兔抗人Ig G,2.63 g/L)和罗丹明标识的奶羊抗兔Ig G二抗(1.5 g/L)购自Invitrogen企业;DNA分子量规范、Prime STAR HS DNA Polymerase、XhoⅠ和Bam HⅠ约束性内切酶及其High Fidelity Prime ScriptTMRT-PCR Kit购自Ta KaRa企业;总RNA获取、质粒提取、DNA提纯检测试剂盒及其T4连接酶购自天根生化高新科技(北京市)有限责任公司;GAPDH抗原(兔抗人Ig G,1 g/L)、β-acting抗原(兔抗人Ig G,1 g/L)购自Affinity企业;Histone H1抗原(鼠抗人Ig G,200 mg/L,Santa企业);HRP标识的奶羊抗兔Ig G二抗(1 g/L)和HRP标识的奶羊抗鼠Ig G二抗(1 g/L)购自Bioworld企业;细胞质蛋白质与细胞核蛋白质抽提检测试剂盒、超敏ECL电化学发光检测试剂盒购自上海市碧云天生物技术性有限责任公司;PVDF膜(Bio-Rad公司);引物合成和DNA测序由英潍捷基上海市貿易有限责任公司进行;GTVisionⅢ型免疫力组织化学诊断试剂盒购自遗传基因高新科技(上海市)股权有限责任公司，肺癌组织芯片(HLug A030PG03)购自上海市芯超生物高新科技有限责任公司。

CO2细胞培养箱(Thermo企业);中小型快速冷冻离心机(Eppendorf企业);蛋白质电泳仪(Bio-Rad公司);Western转印纸仪(Hoefer企业);莹光倒置显微镜、激光器扫描仪共焦显微镜(Leica企业)。

2. 实验方法

2.1 体细胞总RNA的提炼及反转录:

人支气管炎鳞状上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)注射于6填料中，用含法抗和10�S的DMEM塑造至90%汇聚。体细胞经0.25%蛋白酶消化吸收后，500 r/min离心式5 min搜集。按天根生化高新科技(北京市)有限责任公司总RNA获取检测试剂盒(DP419)使用说明实际操作开展体细胞总RNA的获取。将提炼到的体细胞总RNA，按High Fidelity Primer ScriptTMRT-PCR Kit检测试剂盒使用说明书实际操作，反转录得到c DNA。

2.2 人CPNE3遗传基因的增加:

依据CPNE3遗传基因开放阅读框(精彩片段总长1613 bp)，设计方案生成上游引物5’-A C G T C T C G A G A T G G C T G C C C A G T G T G T C A C AA-3’和中下游引物设计5’-A C G TGGATC C GC C TGC TTC TG T T G T T T C G T G G CT-3’，上、中下游引物设计各自添加XhoⅠ、Bam HⅠ酶切位点(下横线为酶切位点编码序列)。以c DNA为模板，PCR扩增CPNE3遗传基因开放阅读框，反映情况为:94℃预转性5 min,94℃转性30 s,65℃淬火30 s,72℃拓宽2 min，循环系统30次，72℃拓宽10 min。经1%琼脂糖电泳电泳原理检验PCR物质，胶回收利用与目地精彩片段尺寸一致的DNA杂带。

2.3 重组质粒p EGFP-N1-CPNE3的搭建:

将p EGFP-N1质粒和CPNE3遗传基因PCR物质，各自用XhoⅠ和Bam HⅠ，在37℃下酶切1 h，胶回收利用提纯酶切物质，并且用T4 DNA连接酶16℃联接留宿。联接物质转换E.coli DH5α感受态细胞，运用卡那霉素抵抗性挑选呈阳性集落，并抽提质粒开展双酶切认证。将挑选到的呈阳性集落送转录组测序。将转录组测序恰当的呈阳性集落注射于含卡那霉素的LB培养基中留宿塑造，搜集菌体，按高纯质粒小提中测检测试剂盒使用说明书实际操作获取质粒，用以事后细胞转染。

2.4 资产重组质粒转染体细胞:

293T和H1299体细胞基本塑造于含法抗和10�S的DMEM培养液，消化吸收并注射6填料。待细胞生长至60%汇聚时，按LipofectamineLTX with PlusTMReagent转染表明，开展p EGFP-N1质粒和p EGFP-N1-CPNE3重组质粒的转染。

2.5 细胞爬片:

293T和H1299体细胞基本塑造于含法抗和10�S的DMEM培养液，消化吸收并注射于挂有细胞爬片的24填料中。待细胞生长至60%汇聚时，按LTX with PlusTMReagent转染表明，开展p EGFP-N1-CPNE3重组质粒的转染，对照实验为p EGFP-N1质粒。

2.6 激光器扫描仪共焦检验:

在2.5中细胞转染48 h后，吸除细胞培养液，用PBS清理2次，添加4%多聚甲醛固定不动10 min,0.2%Triton-100透化10 min。10%羊血清蛋白室内温度封闭式1 h。GAPDH抗原用2%羊血清蛋白按1∶100稀释液，滴边加个爬片上，4℃孵育留宿。PBST浸洗爬片3次，每一次5 min。罗丹明标识的莹光二抗(1∶100)室内温度遮光孵育2 h,PBST浸洗3次。在盖玻片上滴加含DAPI的封片状，将爬片反扣在封片状上，用中性化环氧树脂在爬片四周进行封固。挑选405nm激起光检验DAPI,488 nm激起光检验EGFP和Copine-3-EGFP融合蛋白，552 nm激起光检验GAPDH。在激光器扫描仪共焦显微镜下观查并线片。

2.7亚体细胞组分离出来:

在2.4中细胞转染48 h后，用PBS清理2次，0.25%蛋白酶消化吸收并离心式搜集体细胞。应用上海市碧云天生物技术性有限责任公司的细胞质蛋白质与细胞核蛋白质抽提检测试剂盒，对体细胞亚组份开展分离出来。流程:向搜集的体细胞中添加200μl细胞核蛋白质抽提实验试剂A，强烈涡流使体细胞彻底散掉，冰浴15 min。添加10μl抽提实验试剂B，涡流搅拌5 s，冰浴1 min，再度涡流5 s。4℃，12 000 r/min离心式15 min。将上清液迁移到新的EP管内，获得胞质蛋白质。向沉积中添加50μl细胞质蛋白质抽提实验试剂，涡流搅拌30 s，冰浴30 min，期内每过1～2 min涡流搅拌30 s。4℃，12 000 r/min离心式15 min，迁移上清液到新的EP管内，获得细胞质蛋白质。Bradford测定方法蛋白质浓度值，用以事后Western blotting检验。

2.8 Western blotting检验:

各自取40μg胞质蛋白质和细胞质蛋白质经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离出来，100 V恒流源湿转1 h至0.2μm PVDF膜上，5%低脂牛奶室内温度封闭式2 h,PBST(含0.5%吐温20的PBS溶液)洗膜3次。添加Copine-3抗原(1∶1000),4℃孵育留宿，PBST洗膜3次，每一次8 min。添加HRP标识的羊抗兔Ig G二抗(1∶3000)，室内温度孵育1.5 h,PBST洗膜3次，每一次8 min。向PVDF膜上匀称滴入ECL发亮液，于暗室内显影液。