7、身体之外仿真模拟肽-锌螯合物肠胃消化吸收及锌离解率测量

将制作的肽-锌螯合物溶解pH2.0，37℃双蒸水中，充足混合后向在其中加上2％(w/w)的胃蛋白酶，在37℃标准下水浴摇床酶解2h。水解反应液用分子结构截流量为500Da的透析袋分析5h，搜集透析液，运用原子吸收光度计测量在其中分散锌的成分，点评肽-锌螯合物在胃消化过程中的可靠性，与此同时搜集透析袋内剩下化学物质低温干燥预留。

将历经胃蛋白酶消化吸收后的肽-锌螯合物溶解37℃，pH7．0的溶液中，充足混合后加上2％(w/w)的胰酶，在37℃标准下水浴摇床酶解3h。

接着水解反应液用分子结构截流量为500Da的透析袋分析5h，搜集透析液，运用原子吸收光度计测量在其中分散锌的成分，点评肽-锌螯合物在肠消化过程中的可靠性，与此同时搜集透析袋内剩下化学物质低温干燥预留。

在仿真模拟肠胃消化过程中，锌的离解率理解为在肠胃消化过程中释放出来分散锌的量占消化吸收前opo结构脂肽-锌螯合物中锌的总数量的百分数。

8、肽-锌螯合物中锌的微生物使用率

Caco-2细胞培养基于25cm²细胞培养瓶中，细胞培养液为含有10％胎牛血清，1％非必须氨基酸，100U/mL青霉素钠和0.1mg/mL氨苄青霉素的高糖高热量培养液。塑造标准为37℃，空气湿度90％，CO₂浓度值为5％。当体细胞在塑造瓶中遍布80％时，用含0.5％EDTA的胰酶消化吸收体细胞，随后以4-5×105cells/mL的浓度值注射于6孔Transwell塑造板中。

每过2d换一次细胞培养液，直到细胞培养基21d。随后弃去细胞培养液，用HBSS清理体细胞2-3次，在细胞模型上方和下方各自加上1.5mL和3mLHBSS水溶液。将经肠胃消化吸收后肽一锌螯合物加上高于一切侧，使其终浓度值为1.5mg/mL，接着将加入了试样的Transwell塑造板在37℃下消化吸收转运2h，搜集塑造板下方的水溶液开展分析，各自搜集透析液和分析后的保存物，随后运用原子吸收光度计测量在其中锌的成分，与消化吸收以前较为，测算经消化吸收全过程后分散锌的成分及螯合物中锌的微生物使用率。

9、数据处理方法与数据分析

数据信息結果表明为均值±标准误的方式。选用SPSS19.0(SPSSInc，Chicago，IL)开展数据分析剖析，运用Duncan检测剖析每组数据信息见的显著性差异(α=0.05)。

三、結果与剖析

1、opo结构脂肽的分离纯化

opo结构脂水解反应物经SephadexC25疑胶柱分离出来后的谱图如图所示1所显示。由图1得知，共分离出来获得4组opo结构脂肽成分，F1和F2成分是由流动性相20mM，pH4.0的冰醋酸缓冲溶液过柱得到；F3和F4成分是由流动性相20mM，pH4.0的冰醋酸缓冲溶液和0.5MNaCl一同过柱得到。本实验操作中分离出来opo结构脂肽选用的阴离子互换柱层析，以SPsephadexC-25做为固定不动相，在其中以带负电的磺酸基(一SO₃H)为关键作用团，根据静电感应相互影响对化学物质实现分离出来。因而，F1和F2成分最开始被过柱出来，含有较多的负电；F3和F4成分则含有较多正电。因为F3和F4成分的过柱液中带有NaCI，这两成分必须历经除盐解决。搜集充足量的肽成分后，调整pH为7.0，低温干燥后在一80℃标准下储放预留。

2、opo结构脂肽成分的ζ电势差

分离出来获得的4组opo结构脂成分的外表正电荷特性根据ζ电势差开展明确。由图2得知，从F1到F4成分的ζ电势差慢慢提升，各自为-43mV，-32mV，-11mV和3mV，且彼此之间具有着显著性差异(P＜0.05)。这一测量結果与以上opo结构脂肽成分的分离纯化相一致，F1和F2成分含有较多负电，ζ电势差较低；F3和F4成分最终从SPsephadexC-25正离子互换填充料上过柱出来，所需负电相对性较少，因而ζ电势差较高。不一样的ζ电势差说明opo结构脂肽成分在溶液中可靠性不一样，与此同时也会危害肽与金属离子中间的相互影响及其产生金属材料螯合物的可靠性。比如，有专家研究发现因为带有较多带负电的磷酸基团，opo结构脂磷酸肽在pH转变的标准下依然可以与铁产生比较稳定的一氧化氮合酶。因而，因为ζ电势差的不一样，本实验操作中剥离获得的opo结构脂肽成分鳌合锌离子的功能及其产生肽锌螯合物的可靠性会存有很大的差别。

3、opo结构脂肽成分的碳水化合物构成

小分子活性肽的通电特性在宏观经济上体现了其碳水化合物组合而成的差别。含有负电的成分带有相比较多的酸性氨基酸，而含有正电的成分带有相比较多的碱性氨基酸。选用柱前衍化法对分离出来获得的opo结构脂肽成分的碳水化合物构成开展剖析，結果如表1所显示。F1-F3成分中酸性氨基酸成分高过偏碱氨墓酸成分。在其中，F1成分中酸性氨基酸(Asp和Glu)成分占总碳水化合物成分的42.64％；F2成分中酸性氨基酸成分占33.84％；F3成分中碱性氨基酸(His、Arg、Lys)成分显著高过F1和F2成分，做到15.33％。因而，F1、F2和F3可看作带负电的成分，掌电势差较低。F4成分中偏碱碳水化合物成分高过酸性氨基酸成分，碱性氨基酸占碳水化合物数量的37.90％。F4为带正电成分，亭电势差较高。除此之外，有科学研究报导，具备融合二价金属离子工作能力的氨基酸残基包含Asp、Glu、His、Ser、Cys、Asn和Gin，这种氨基酸残基在4组opo结构脂肽成分中的成分各自为55.5％、40.4％、29.4％和26.1％。再融合碳水化合物构成剖析得知，分离出来获得的4组opo结构脂肽成分都能够鳌合锌离子，而且鳌合锌的实力从F1成分到F4成分慢慢变弱。