做为一种必不可少的营养元素，锌对身体的发育和免疫力作用的健全特别是在关键。因为身体沒有专业的锌贮藏点，人体必须根据日常饮食附加填补充分的量来维系身体锌的平衡状态。现阶段全球资本主义国家中大概有22亿人口数量遭受锌缺少的危害，尤其是宝宝、孕妈妈、哺乳期间的女生及其老人受影响最比较严重。因而，推动饮食中锌的消化吸收变成当今营养成分分析的网络热点。

锌在人体内的溶出度非常大水平上在于其在结肠内的消化吸收。食材栽培基质中的成份，比如植酸、花青素、人参皂甙和膳食纤维等，会与锌融合产生不可溶的一氧化氮合酶，进而阻拦锌的消化吸收，造成身体锌欠缺。食材中别的矿物，如铁、钙、碘离子也会竞争地与媒介融合而抑止锌的消化吸收。根据填补碳酸盐(ZnSO₄，ZnO)是一种普遍的防止锌缺少的方式，可是含铁的碳酸盐不但会变化食材的物理化学和感观特性，还会继续造成消化道不适感，不适合长期性摄取。相关食源性活性多肽做为配位与锌融合，进而提升锌的吸附在世界各国已经有科学研究，活性多肽被觉得是一类十分有潜能的推动锌消化吸收的化学物质。opo结构脂是牛乳中的关键蛋白，约占总蛋白的80％，是多种多样生物活性肽的来源于；在其中，opo结构脂磷酸肽早已被证实可以与锌融合，而且具备不错的促锌消化吸收实际效果。可是因为肽一锌螯合物在消化道内可靠性的难题，造成 锌的消化与在身体的微生物使用率有较大差别。由于锌离子含有正电，肽的构造特性尤其是正电荷特性(正负极性和净电荷量)，根据静电感应相互影响，对其鳌合锌离子的功能及其螯合物在消化道内的稳定尤为重要，会影响到锌的最后消化吸收和微生物使用率。可是，现阶段有关肽的正电荷性对肽一锌螯合物在消化道内消化和吸收危害的体系科学研究欠缺报导。

因而，本试验以opo结构脂为原材料，经碱性蛋白酶水解反应后选用阳离子交换色谱层析分离opo结构脂肽，并制取肽-锌螯合物。试验中对分离出来获得的opo结构脂肽的掌电势差及其碳水化合物构成开展测量，与此同时选用身体之外胃酸-肠液-Caco-2体细胞的三段式消化模型模拟肽-锌螯合物的肠胃消化和吸收，以锌离子的分析率是关键评定指标值，调查肽的正电荷特性对肽-锌螯合物肠胃消化吸收可靠性和锌微生物使用率的危害，結果有希望为opo结构脂肽在补铁保健品企业的使用给予参照。

一、试验原材料与机器设备

1、试验原材料

opo结构脂(商品编号：C3400)，碱性蛋白酶(Alcalase，P4860=2.4U/g)，胃蛋白酶(P7000=250U/mg)，胰酶(P1750，4XUSPspecifications)，异硫氰酸苯酯(PITC，P1034)，三乙胺(Triethylamine，T0886)，17种碳水化合物混和标准物质(AASl8)选购于Sigma企业；高糖高热量培养液(DMEM)，胎牛血清(FBS)，非必须氨基酸(NEAA)，青霉素钠-氨苄青霉素溶液，HBSS(Hank’Sbufferedsalinesolution)，胰酶-EDTA选购于Hyclone公司(ThermoScientific)；25cm²细胞培养瓶(Nunc)，6孔Transwell细胞培养板(Nunc，直径0.4μm，总面积4.2cm²)，透析袋选购于北京索莱宝企业；ZORBAXSB-C18离子交换柱(250×4.6mm，安捷伦)；SephadexC25疑胶柱层析填充料，选购于GEHealthcare生物科学有限责任公司；Caco-2体细胞，选购于中科院上海细胞库；别的实验试剂均为分析纯，购于国药控股化学药品有限责任公司。

2、实验室仪器

LC-15高效率液相色谱、AA-7000原子吸收光度计，购于安捷伦仪器进出口贸易(上海市)有限责任公司；HZS-HA恒温水浴槽震荡器、DL-CJ-1N净化工作台，购于哈尔滨市东联电子器件科研开发有限责任公司；RE-52型旋转蒸发器，购于上海亚荣生物化学仪器厂；BT-100B数显式恒流泵、HD-5电脑上紫外线检查仪、HD-A电脑上数据采集器，均购入于青浦区沪西仪器厂；Nano-ZS90纳米技术粒度分布电位差仪，选购于美国Malvem企业；Infinite200Pro多用途酶标仪，选购于法国TecanTradingAG；3111型二氧化碳恒温箱，购于ThermoScientific；LGJ-18冷冻式干燥机，购于北京四环科学研究仪器厂。

二、实验方法

1、opo结构脂水解反应

将opo结构脂固态粉末状溶解双蒸水中，使其含量为5％(w/v)，用0.5MNaOH调整pH为8.0，将opo结构脂水溶液在60℃水浴中加热10min。接着向在其中加上碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的增加量为opo结构脂品质的2％，在60℃水浴摇床中酶解4h，在酶解全过程中运用0.0lMHCI和0.5MNaOH操纵水解反应液pH为8.0。酶解完毕后，将水解反应液烧开灭酶15min，制冷至常温后，用0.01MHCI和0.5MNaOH调pH至7.0，接着在4℃8000r/min标准下离心式15min，随后取上清液浓缩后低温干燥，-80℃超低温储存。

2、opo结构脂肽的分离出来

将以上制取获得的opo结构脂水解反应物复溶解20mM，pH4.0的冰醋酸缓冲液中，使其含量为400μlg/mL，充足融解后，选用0.45μm水系滤膜过虑，渗沥液经SephadexC25疑胶柱层析开展分离出来。在0～120min内，选用冰醋酸缓冲液(20mM，pH4.0)做为过柱液开展过柱；120～240min内，选用冰醋酸缓冲液(20mM，pH4.0) 0.5MNaCI做为过柱剂完成过柱。全部过柱全过程中，操纵隔膜泵的水流量为3.0mL/min。过柱液选用紫外线探测器检验，光波长为220nm，选用系统软件内置的HD-A色谱仪解决系统软件纪录分离出来流程中图普的转变，依据检测到的试品峰开展试品搜集。搜集获得的opo结构脂肽成分经转动蒸发浓缩后，低温干燥，一80℃遮光储存。

3、opo结构脂肽成分的ζ电势差测量

opo结构脂肽成分ζ电势差选用电位差检测仪开展测量。opo结构脂肽溶解双蒸水中，充足混合后使其含量为1mg/mL。接着运用纳米技术粒度分布电位差仪对分离出来获得opo结构脂肽成分的ζ电势差开展测量，剖析时毛细血管试品池需在25℃标准下均衡120S。

4、碳水化合物构成剖析

精确称量2g被测试品于具塞试管刷中，随后添加2.0mL6M的硫酸，接着在110℃烘干箱中开展全水解反应24h。水解反应完毕后，在40℃烘干箱中烘干处理。接着用双蒸水开展融解，使其含量为2mg/mL，取200此于深棕色瓶中，向在其中加上100μL0.1M的异硫氰酸苯酯和100μL1M的三乙胺，漩涡震荡后，置放于室内温度黑喑情况下反映1h。反映完成后，向以上反映系统中添加400μL正己烷，漩涡震荡搅拌，静放10min后汲取下一层液态，过0.22μm水系滤膜后开展高效液相色谱色谱。高效液相标准如下所示，流动性相A：10mM，pH6.9的磷酸缓冲液；流动性相B：乙腈。过柱梯度方向：1～5min，5～10％B；5～25min，10～21％B；25～45min，21～35％B；45～48min，35～100％B；48～50min，100％B；50～58min，100～5％B；58～60min，5％B。

流动速度：1.0mL/min，检验光波长：254nm，进样量：5μL。选用与以上同样的办法对碳水化合物标准物质开展测量，随后以浓度值对峰总面积做出碳水化合物标准物质曲线图。每一种碳水化合物的成分表明成g/100g。

5、锌鳌合工作能力测量

opo结构脂肽的锌鳌合工作能力的测量参照Jakob等的方式 。将试品溶解40mM羟乙基哌嗪乙磺酸-KOH缓冲液中(pH7.5)，使其含量为1Mg/mL。取250mL试品水溶液与125μL8mM的二硫苏糖醇和125μL250μM的ZnS0₄ 7H20混和，充足搅拌后在37℃标准下反映10min，接着向当中添加25μL2mM的4-(2-吡啶甲酰胺)间苯二酚，搅拌后在500nm处测量吸光度值。与此同时以不用opo结构脂肽试品做为空缺组，以EDTA做为呈阳性对照实验开展实验。锌鳌合工作能力的计算方法如下所示：

C=[(A_空缺一A_试品)/A_空缺]×100。

6、肽-锌螯合物的制取

将ZnS0₄·7H₂0溶解pH7.0的聚磷酸盐缓冲溶液中，浓度值为50μM，接着将opo结构脂肽溶解以上水溶液中，使其终浓度值为10mg/mL，搅拌后，在常温下混合反映1h。接着，用分子结构截流量为500Da的透析袋分析5h，除去反映液中的分散锌，搜集透析袋内的保存物低温干燥后获得肽-锌螯合物。