3、色谱标准

Agilent5HC-C18（2）（4.6×250mm，5μm）离子交换柱，进样量20μL，流动速度1.0mL/min，柱温35℃，以工业甲醇做为流动性相A，以0.02moI/L乙酸铵水溶液为流动性相B，梯度方向过柱，过柱标准见表1。应用二极管列阵探测器，光谱仪范畴190～700nm；光谱仪步进电机数值2.0nm，光谱仪收集方式。以保存期及光谱图判定，在230nm和625nm光波长下开展检验，峰总面积外标法定量分析。

二、結果与探讨

1、色谱仪标准的提升

本实验较为乙腈-0.02mol/L乙酸铵和工业甲醇-0.02mol/L乙酸铵按表1梯度方向开展过柱时，发觉新红与苯甲醛，靛青与脱氢乙酸分离度达不上1.5的规定，缘故将会有几个方面：最先，乙腈过柱工作能力比工业甲醇强，在UV光波长较短的色谱上具备较高灵敏，且色谱仪级的乙腈是吸收力较为小的有机溶液，故乙腈过强的过柱工作能力及其乙腈独有的特性都是会导致出峰時间靠前的目的物和残渣峰或是邻近的峰离不开；次之，苯甲醛、山梨酸、脱氢乙酸、纳他霉素旋光性相较柠檬黄、日落黄、诱惑红旋光性稍强，选用乙腈阶梯性梯度方向过柱，出峰速度更快，控制不了栽培基质基准线影响；其次，点心中的栽培基质大部分为碳酸盐、蛋白、糖原等，乙腈过柱不可以合理规避这种栽培基质对目的物的影响，实验中也根据调节梯度方向过柱的占比，可是不管怎样调节依然不能将13种总体目标物彻底分离出来，殊不知选用工业甲醇过柱可以有效的防止乙腈存有的这种难题，結果见图1。此次实验还挑选了工业甲醇一0.02mol/L乙酸铵与工业甲醇-0.02mol/L磷酸二氢铵水溶液开展梯度方向过柱，13种食用添加剂均为旋光性化学物质，与水均能相溶，选用0.02mol/L磷酸二氢铵对添加剂的分开沒有危害，可是这一水体的流动性相对性色谱仪分离出来危害很大，绝大多数色谱仪均不可以合理过柱，結果见图2，综合性考虑到，本实验最后挑选工业甲醇一0.02mol/L乙酸铵按表1程序流程开展分离出来。

2、试品前解决提升

（1）蛋白质混凝剂的挑选

人造黑色素与添加剂、甜味素的前解决办法不一样，参照有关参考文献，此次实验对于点心中的栽培基质，挑选水体蛋白质混凝剂，即106g/L亚铁氰化钾和219g/L乙酸锌水溶液做好解决，这二种水体蛋白质混凝剂均为中性盐，中性盐对蛋白的溶解性有明显危害，亚铁氰化钾和乙酸锌沉积蛋白是一种蛋白质变性反映，因为蛋白是一种胶体溶液，乙酸锌与亚铁氰化钾反映产生的氰亚铁酸锌沉积可以挟走或吸咐影响化学物质，且这二种中性盐除蛋白质工作能力强，与此同时浓度较高的的盐正离子凝固工作能力很强，可以将蛋白质分子的凝固层夺得，由于各种各样蛋白质分子颗粒物的大小不一样，故蛋白质变性需要的含盐量也不一样，此次实验历经多次检测，最后选用106g/L亚铁氰化钾水溶液和219g/L乙酸锌解决试品中蛋白实际效果最好。

（2）固相萃取柱的挑选

此次实验根据试品加标回收开展调查，各自称量呈阴性试品6份，每一份2.59，各高精密添加规范混和贮备液1.0mL，其他称量破碎匀称的点心试品2.5g置50mL离心管架中，加25mL水，各加5mL106g/L亚铁氰化钾水溶液和5mL219g/L乙酸锌水溶液，涡流10min后，放水滴定剂至50mL，经10000r/min冷藏离心式10min后取下，量取上清液5mL过QasisWAX固相萃取小柱（事先经3mL工业甲醇及其3mL水活性），弃去排出液，先后用6mL2％苯甲酸和6mL纯水系统清理，再用5％氨解工业甲醇过柱并搜集于15mL离心管架中，在40℃水浴中氮吹至近干后取下置放室内温度，用5mL水复溶沉渣，过0.45μmGHP微孔滤膜后，被测。

結果见表2，从结论还可以看得出，WatersOasisWAX固相萃取小柱利用率最大，对这次实验的13种食用添加剂聚集比较好，WatersOasisHLB固相萃取小柱和WatersOasisMCX固相萃取小柱利用率其次，缘故可能是，WatersOasisWAX固相萃取小柱特性为复合型弱阳离子互换正相反吸收剂，具备弱阳离子互换和非极性亲水性双向功效的混和吸收剂，对强酸碱性化学物质具备高的目的性和敏感度，含弱碱性的胺基作用官能团，适用从偏碱或中性化化学物质中分离纯化酸性物质，可用以强酸碱性化学物质的解决，此次实验的13种添加物均为水溶化学物质，选用WAX开展聚集，2％苯甲酸清理可以将试样中正离子状况的杂物清理除去，再用5％氨解工业甲醇将聚集在固相萃取小柱分子结构情况的食品添加剂开展离子化过柱出来；WatersOasisHLB内的吸收剂是根据一个“独特的旋光性捕捉官能团”来提升对旋光性有机物的保存给予不错的水浸润性，用以酸碱性，中性化和偏碱化学物质的通用性吸收剂，这类特性用以剖析人造黑色素很好的，可是这一小柱对添加剂中的纳他霉素和富马酸二甲酯的保存聚集实际效果较弱，缘故可能是HLB内填充料是亲脂化学物质，而纳他霉素和富马酸-ep酯是吸水性的，WatersOasisMCX固相萃取小柱是复合型正离子互换正相反吸收剂，对偏碱化学物质具备高的目的性和敏感度，MCX小柱对一部分黑色素和添加剂的聚集实际效果也非常差，不可以与此同时对13种成份开展剖析，故此次实验挑选WatersOasisWAX固相萃取小柱开展。