以多巴（L-DOPA）为底物，测量色氨酸酶的活性。先将被测试品用乙醇融解，配置成浓度值为1Mg/ML的储备液，再逐个稀释液成不一样含量的试品水溶液。按表2所显示，先后精确汲取不一样含量的试品水溶液，pH6.8的0.5MoL/L聚磷酸盐缓冲液，0.5MMoL/LL-DOPA水溶液和0.15Mg/ML酪氨酸酶水溶液，充足搅拌，在37℃恒温水浴锅中孵育反映30MiN，随后马上测量各试管婴儿中反映水溶液在475NM处的吸光度值。以上实验均反复3次。依据酶反映特异性的界定，在一定的缓聚剂浓度值下，酶反映活力表明为ACTi，在沒有缓聚剂时酶反映活力表明为ACT0，则受试试品对酶的相对性抑制率（I）能够界定为：
 

式中，ACTi—有缓聚剂时的酶反映活力；ACT₀—沒有缓聚剂时的酶反映活力；A₁，A₂，A₃，A₄—1，2，3，4号反映液的吸光度值。

1.2.7 B16黑素瘤体细胞体细胞MTT实验

称量50g重络酸固态，以100ML纯净水100℃融解（电炉加热），迅速添加900ML浓H₂sO₄，搅拌，制冷就可以应用。MTT用PBs配置成浓度值5Mg/ML，过0.22μM水相滤纸后存于10ML无菌检测离心管架中，于-20℃冷藏储存。操作步骤：

1）取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果素的标准物质

20Mg，添加DMsO融解配出500MMoL/L的水解液，过0.22μM有机滤膜后以每管20μL散装于无菌检测的200μL离心管架中，于-20℃冷藏储藏。

2）不一样浓度值试品的配置

各自取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果素3种化学物质500MMoL/L的水解液各4μL，添加4ML1640基本培养液中，配出500μMoL/L的水溶液，随后各自稀释液到250，125，62.5μMoL/L3个浓度值。

3）96孔细胞培养板塑造体细胞

在净化工作台中移取5ML75T细胞培养瓶停止消化吸收后的体细胞与细胞培养液的溶液于离心管架中，800r/MiN离心式4MiN，弃上清液，移取3ML完全培养基于离心管架并搅拌细胞液，取以上1ML细胞液，加1ML完全培养基，取80μL于平板电脑电子计数器记数，用完全培养基稀释液调节体细胞浓度值为8000个体细胞/100μL，用12安全通道移液器将细胞液搅拌，添加96孔细胞培养板，每孔添加100μL，搞好标识后将细胞培养板放进CO2恒温培养箱塑造24h。

4）96孔细胞培养板中添加试品

将以上96孔细胞培养板放进CO2恒温培养箱塑造24h，用废水机械泵吸弃细胞培养液，每孔添加不一样含量的试品150μL，而且每片96填料都需要留1到2列只加基本培养液做空白试验，搞好标识后将细胞培养板放进CO2恒温培养箱塑造24h。

5）B16黑素瘤細胞的MTT实验

在超净台中，取PBs配出浓度值5Mg/ML的MTT水溶液，与基本培养液以容积比1∶9的比率配出MTT细胞培养液。将流程4）里加试品塑造24h后的细胞培养液用废水机械泵吸弃，每孔添加150μLMTT细胞培养液，搞好标识后将细胞培养板放进CO2恒温培养箱塑造4h，吸弃MTT细胞培养液，每孔添加150μLDMsO，于酶标仪中震动10MiN后测量光波长490NM处的OD值值。

体细胞成活率=（A₀-Ax）/A₀×100%

式中，A₀—不用试品的空缺OD值值；Ax—加不一样浓度值试品功效后的OD值值。

1．2.8 B16黑素瘤体细胞HoeChsT莹光上色实验

实际操作流程：

1）于净化工作台上，开启六填料，置杀菌盖玻片。将体细胞悬液体加至盖玻片上，置CO2摩尔分数为5%的恒温箱中，37℃塑造至体细胞接触抑制（约2h），添加2ML细胞培养液再次塑造约6h。弃培养液，用PBs洗3次，每一次5MiN。

2）用4%多聚甲醛固定不动30MiN，PBs洗3次，每一次5MiN。

3）切成片稍脱水后在圈里滴入适当HoeChsT染色液到爬片上，室内温度遮光孵育15MiN。

4）PBs浸洗爬片3次，每一次5MiN，从六填料内取下爬片，将有体细胞的一面封到滴加上抗荧光淬灭封片状的玻璃片上，光学显微镜下观查并照相。

1.2.9 NariNgiNDC与双孢蘑菇酪氨酸酶的分子对接

选用CheMBioDrawULTra14.0绘制化学物质熊果素和NariNgiNDC的构造，随后用CheMBio3DULTra14.0转换为三维构造，用MMFF94引力场开展提升。双孢蘑菇酪氨酸酶的三维构造（PDBiD：2Y9X）从RCsB蛋白质数据库下载。酪氨酸酶和化学物质均应用AuToｄoCkTooLs1.5.6转换为PDBQT文件格式。选用AuToｄoCkviNa1.1.2开展分子对接。酪氨酸酶活力结构域的座标设定为：CeNTer_x=-10.044，CeNTer_y=-28.706，CeNTer_z=-43.443；size_x=15，size_y=15，size_z=15。为了更好地提升测算的精确度，将主要参数exhausTiveNess设定为20。其他参数均用初始值。最终，选择打得分最大的构像用PyMoL1.7.6开展結果剖析。

2 結果与探讨

2.1 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及原儿茶醛对ABTS氧自由基的清理实际效果

以TroLox做为对比，以其浓度值-吸光度值制作标曲y=0.3627x 0.0661（R2=0.9943），科学研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及原儿茶醛4种试品对ABTs氧自由基消除实际效果，結果见图3。4种试品对ABTs氧自由基消除实际效果以TroLox的抗氧化性摩尔质量表明，結果见表3。

由表3得知，4种试品对ABTs氧自由基均有消除功效。以TroLox做为对比，4种试品的总抗氧化能力結果中，柚皮苷的TroLox抗氧化性摩尔质量为0.1748MMoL/g，NHDC为2.9109MMoL/g，NariNgiNDC为0.6986MMoL/g，原儿茶醛为39.6103MMoL/g。4种试品对ABTs氧自由基消除工作能力先后为原儿茶醛＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

2.2 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及原儿茶醛对羟氧自由基的清理实际效果

以TroLox为对比，以其浓度值-吸光度值制作标曲y=4.0588x 0.079（R2=0.9998），科学研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及原儿茶醛4种试品对羟氧自由基消除实际效果，結果见图4。4种试品对羟氧自由基消除实际效果以TroLox的抗氧化性摩尔质量表明，結果见表4。

由表4可看得出，4种试品对羟氧自由基均有消除功效，实验中以TroLox做为对比，获得柚皮苷消除工作能力的TroLox摩尔质量为19.8μMoL/g，NariNgiNDC为31.9μMoL/g，NHDC为44.4μMoL/g，原儿茶醛为365.5μMoL/g。4种试品消除羟氧自由基工作能力先后为原儿茶醛＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。