伴随着大家对氧自由基性命科学研究的持续关心，氧化应激损害和抗氧化性维护功能的分析变成网络热点。因身体中抗氧化性的化学物质比较有限当还原剂与人体内抗氧剂不平衡时，人感受处在氧化应激情况。当身体的还原剂浓度值超出体细胞防御力时，空气氧化损害可造成如癌病，多发性硬化症症和心脑血管疾病等病症。现阶段最多见的是有机化学抗氧剂，但因其有一定的副作用因此应用受限制。近些年研究发现，由胰蛋白酶水解反应制取的生物活性肽具备一定的抗氧化能力，水解反应出的抗氧化性肽与生物大分子蛋白对比，显具备更好的生物活性，抗氧化性肽在身体内累积具备降低胆固醇和抑止脂质过氧化的作用，可以保持人体内氧自由基的均衡，进而增强人体延缓衰老和抗病症的工作能力。抗氧化性肽以其具备安全性、高效率、易消化吸收等特性，在健康保健、诊疗等行业得到了管饭的高度重视。

黑豆别名青豆豆，归属于医食双用农作物，是在我国具体的农作物之一，在国内多地域栽种，年平均生产量在6l万吨级且含有优质的大豆蛋白，是高质量的食品工业原材料。服用黑豆好处多种多样，如能够软化血管、提升 人体免疫能力、防止变老及其具备抗氧化性等功效。黑豆活性多肽中的抗氧化性小分子活性肽相对性分子质量小，具备优良的水溶、低粘度、可靠性强，是自然的抗氧剂，可以具有消除身体氧自由基、抑止分子伴侣化学物质过氧化物的功效，具备防衰老、预防传染病等优势，有很高的使用使用价值。但就现在来讲，黑豆抗氧化性活性多肽的配制技术科学研究较少，不可以符合目前的要求，产品成本较高，制取加工工艺不太完善，针对黑豆活性多肽获取的探究拥有 主要实际意义。

一、原材料与方式

1、原材料及实验试剂

黑豆蛋白质：试验室自做；硫酸：中国药业上海市化学药品企业；碱性蛋白酶(6000U/g)：Sigma试剂公司；氢氧化钠溶液、DPPH、工业乙醇：之上均为分析纯，均购自天津科密欧实验试剂有限责任公司。

2、关键实验仪器

紫外线由此可见分光光度仪：上海市舜宇恒平仪器设备有限责任公司；电加热恒温水浴锅：上海博讯实业公司有限责任公司诊疗机械厂；高精密pH计：梅特勒托利多仪器设备(上海市)有限责任公司；干燥烘箱：湘仪离心机仪器设备有限责任公司；电子分析天平(RSJ200—4)：湘仪离心机仪器设备有限责任公司；离心脱水机(TDZ5一WS)：湘仪离心机仪器设备有限责任公司。

3、实验方法

（1）黑豆抗氧化性肽的制取

将黑豆蛋白质配备成一定含量的水溶液，水浴加热至100℃开展15min匀质解决。待水溶液降温至酶解适宜溫度，水浴隔热保温，向水溶液中添加0.5mol／L的NaOH调整其pH，酶解一段时间后100℃水浴消灭10min，室内温度下离心式(4000r／min，20min)，将上清液干冻后储存。

（2）DPPH氧自由基消除工作能力的测量

参考于慧等的办法开展DPPH氧自由基清除率的测量。将2mL一定含量的黑豆活性多肽水溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH水溶液开展混和，遮光于25℃标准下反映30min，取下后于517nm光波长下开展吸光度值的测量，这时OD值值纪录为A_i；将以上全过程中的2mLDPPH水溶液用没有水酒精替代，随后与2mL黑豆活性多肽水溶液开展反映，此前提下测量吸光度值纪录为A_j，将2mL工业乙醇与2mLDPPH水溶液反映的标准做为空缺组，这时纪录吸光度数值Ao。
DPPH清除率计算方法如下所示：

A_i：试品组OD值值；

A_j：对照实验OD值值；

A₀：空缺组OD值值。

（3）单要素试验

本试验取决于科学研究酶法对黑豆蛋白质水解反应的抗氧化性肽的技术提升，故以DPPH为指标值，挑选酶解時间、酶解溫度、酶加上量及其pH为要素开展单要素试验。

①酶解溫度对黑豆活性多肽抗氧化的危害

将底物浓度值为4％、pH为9、酶解時间3h做为固定不动标准，测量当酶解溫度各自为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五个标准下时的DPPH清除率。

②酶浓度值对黑豆活性多肽抗氧化的危害

将pH为9、酶解溫度50℃、酶解時间3h做为固定不动标准，测量当酶浓度值分別为2％、4％、6％、8％、10％五个标准下时的DPPH清除率。

③pH对黑豆活性多肽抗氧化的危害

将底物浓度值为4％、酶解溫度50℃、酶解時间3h做为固定不动标准，测量当pH各自为7、8、9、10、11五个标准下时的DPPH清除率。

④酶解時间对黑豆活性多肽抗氧化的危害

将底物浓度值为4％、pH为9、酶解溫度50℃做为固定不动标准，测量当酶解時间各自为0.5h、lh、2h、3h、4h五个标准下时的DPPH清除率。

（4）响应面可靠性设计

根据单要素试验的結果，能够挑选出各要素的三个水准。因此在这个基础以上，运用数据分析手机软件创建4要素3水准的Box—Behnken实体模型，开展回复面可靠性设计。要素和水准选值如表1所显示。

二、結果与探讨

1、单要素试验結果

（1）黑豆活性多肽抗氧化与酶解溫度的关联

将黑豆蛋白质配备成一定含量的水溶液，水浴加热至100℃开展15min匀质解决。待水溶液降温至酶解适宜溫度，水浴隔热保温，向水溶液中添加0.5mol／L的NaOH调整其pH，酶解一段时间后100℃水浴消灭10min，室内温度下离心式(4000r／min，20min)，将上清液干冻后储存。結果如图所示1所显示。

由图1得知，当酶解溫度小于50℃，DPPH清除率与气温正相关，当气温超出50℃时，DPPH清除率逐渐降低。这是由于胰蛋白酶对平稳的需求较高，溫度过低会危害酶解的反应速率，使酶解反映不完全，进而危害抗氧化性肽的抗氧化性实际效果。而气温过高而会危害蛋白质酶的活性，使蛋白质酶的活性减少，没法使蛋白质水解反应成具备抗氧化的小分子活性肽段，进而使DPPH清除率减少。