2.3 UPLC-DAD-BChE线上统计分析方法

2.3.1 UPLC色谱仪标准

离子交换柱Xtimate UPLC C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；流动速度：0.08 mL·min-1；流动性相:工业甲醇(B)-0. 1%苯甲酸溶液(A)。

吴茱萸色谱仪标准：检验光波长330 nm；梯度方向过柱:0～5 min，10%B；5～50 min，10%～45%B；50～70 min，45%～95%B；70～85 min，95%B。

钩藤色谱仪标准：检验光波长 245 nm；梯度方向过柱:0～10 min，10%～30%B；30～70 min，30%～45%B；70～90 min，45%～95%B；90～100 min，95%B。

玄参和山豆根（苗）色谱仪标准：检验光波长225 nm；梯度方向过柱:0～5 min，5%B；10～40 min，5%～50%B；40～80 min，50%～95%B；80～90 min，95%B。

莲芯碱色谱仪标准：检验光波长：290 nm；流动性相：工业甲醇（B）-0.1%苯甲酸水溶液（A）（20:80）。

UPLC流动速度：0.08 mL·min-1；柱后BChE、DTNB混和水溶液和BTCI流动速度各自为0.30 mL·min-1和0.10 mL·min-1。

2.3.2 UPLC-DAD-BCD线上联用仪器设备系统软件

UPLC-DAD-BCD联用仪器设备设备见图1。水溶液流路选用三通管和同样直径的PEEK管联接。柱后衍化仪泵一为酶和DTNB混和水溶液，泵二BTCI水溶液。提取液历经UPLC离子交换柱分离出来后，在PDA探测器表明指纹图谱，再与柱后衍化仪中的水溶液反映，经 DAD探测器检验获得活力图普，酶 DTNB、BTCI水溶液流动速度各自为0.30和0.10 mL·min-1，反映管0.5 mL，在405 nm检验酶抑止活力图普。其反映基本原理如下所示：当柱后衍化仪以稳定的流动速度运送BChE与DTNB混和水溶液和BTCI水溶液，3种水溶液在反映管内持续反映，转化成的5-thio-2-nitrobenzoate为淡黄色物质，可在405 nm处检验获得稳定基准线。当UPLC分离出来出活性物质进到BChE反映管理体系，淡黄色物质量减少，与此同时在DAD探测器上边便会展现倒峰，进而完成BChE缓聚剂的在线监测。

2.4 UHPLC-LTQ/Orbitrap MS方式

UHPLC剖析标准同“2.4.1”，流动速度为0.2 mL·min-1。

质谱分析标准：电喷雾器正离子源（ESI）共价键方式；鞘气（N2）和輔助气（Ar）流动速度各自为40和10 arb. unit；毛细血管溫度320 ℃；离子源工作电压3.5 kV，电流量100 μA；一级质谱分析品质扫描仪区域为100～1 000 m/z，屏幕分辨率为60 000；二级质谱分析选用HCD方式，依靠一级质谱分析扫描仪中的1th到5th强峰，屏幕分辨率15 000；HCD裂化动能35 V。

3 結果与探讨

3.1 UPLC-DAD-BChE线上统计分析方法的调查

流动性看中的工业甲醇和乙腈能减少酶的活性，选用HPLC创建在线监测方式需根据柱后分离减少流动性相在酶反映机制的占比，降低对酶促反应的危害，此线上联用方法会造成仪器设备的兼容模式等难题，造成 在线监测方式可靠性较弱。本探讨选用UPLC使流动速度为0.08 mL·min-1，不分离就可以达到在线监测的规定。

莲子芯被报导具备BChE抑制效果，依照“2.3.2”项下的方式 ，应用UPLC-DAD-BCD对莲芯碱抑止活力开展剖析，见图2。图2为五个不一样浓度值莲芯碱的UPLC图普和BChE抑止峰(60，120，600，1 200和 1800 μg·mL-1)，以活力指纹图谱的倒峰总面积为横坐标轴（X），莲芯碱浓度值为纵轴（Y），获得莲芯碱的量效曲线方程Y= 351.56X3-1 098.8X2 1 473X-32.205 (R² = 0.999 7)，说明UPLC-DAD-BCD方式可以用以酶抑制剂的挑选和活力点评。由图二上和下相匹配峰的保存期可获得在线监测的时间延迟为2 min上下。