溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）又被称作胞壁质酶（Muramidase）、N-乙酰胞壁质聚糖核糖核苷酸（N-acetylmuramideglycanohydrlase），能够目的性地水解反应细菌细胞壁上肽聚糖的β-1，4糖苷键，促使体细胞在融解身亡的与此同时，不毁坏其他机构，是一种纯天然、安全系数优良的农药杀菌剂和添加剂，具备抑菌、消肿、抗病毒治疗等功效，可普遍使用于食品类微生物防腐蚀、药业、日用化工厂等领域。现阶段研究表明，生鸡蛋鸡蛋清是溶菌酶生产制造的具体原材料，其溶菌酶的成分可做到0.2%～0.4%，殊不知，鸡蛋清中富含很多种蛋白，需对鸡蛋清中的溶菌酶开展分离出来纯化。

现阶段，常见的溶菌酶提纯方法包含结晶法、亲和力膜色谱分析、离子交换、超滤膜法等。Curcio等选用静态数据膜结晶法以NaCl为混凝剂，MgCl₂水溶液为过柱液，醋酸钠溶液为缓冲溶液调整鸡蛋清液pH值，静放1d后溶菌酶以结晶方式进行析出，其使用简易，殊不知生产制造时间长，原材料利用效率低，且制取的溶菌酶纯净度较低。Ho用活力红120对带磁壳聚糖脂质体表层完成改性材料，并选用聚磷酸盐缓冲溶液做为过柱液，制取的溶菌酶解析率是92.6%，利用率为89.1%，其制取的溶菌酶纯净度高，殊不知实际操作难度系数很大，成本增加，无法运用于工业生产。离子交换可运用树脂吸附与蛋白相互之间的结合性不一样具有分离出来实际效果。余海芬等选用正离子互换环氧树脂法，以硫酸铵为过柱液获取鸡蛋清溶菌酶，制取溶菌酶比酶活达9500U/mg，其使用简易，生产制造周期时间短，高效率，合适工业生产。超滤膜法以陶氏反渗透膜两边压差为驱动力，根据操纵膜直径的大小开展蛋白的分离出来。Mayani等用超滤膜法所制成的鸡蛋清溶菌酶纯品纯净度达96%，利用率为75%，其使用简易、迅速，相较其他方式标准柔和，是微生物工业生产行业中较有潜质的蛋白分离出来技术性。综上所述，目前的溶菌酶获取方式均存有一定的缺点，因而，本科学研究协作应用离子交换、超滤膜法，科学研究一种新式、高效率的纯化溶菌酶的方式 ，即采用724正离子互换环氧树脂对溶菌酶开展非特异吸咐，过柱后经二步超滤膜得到特制溶菌酶，经单要素实验、Box-Behnken实验提升纯化加工工艺主要参数，并对纯化后的溶菌酶酶学特性开展基本表现。

1 原材料与方式

1.1 原材料、实验试剂与仪器设备

新鮮生鸡蛋，市面上；溶菌酶标准物质，南京建成微生物有限责任公司；溶壁微革兰阴性杆菌（MicrococcuslysodeikticusFleming，储藏序号：GＩM1.132），广东微生物菌种储藏核心；724孔眼酸性正离子互换环氧树脂，郑州市勤实高新科技有限责任公司；蛋白标准物质，南京建成微生物有限责任公司；其他实验试剂均为分析纯级实验试剂。

pH计，上海市梅特勒-托利多仪器设备有限责任公司；快速冷冻离心机，安徽省嘉文仪器设备武器装备有限责任公司；由此可见-紫外线光度计，上海市棱光技术性有限责任公司；YXQ-LＳ-18ＳＩ立柱式工作压力灭菌设备、ＳW-GＪ-1R净化工作台，上海博讯实业公司有限责任公司诊疗机械厂；GXZ-300D生化培养箱，宁波市东南方仪器设备有限责任公司；DHG-9194A电加热干燥烘箱，上海精宏实验仪器有限责任公司。

1.2 实验方式

1.2.1 获取溶菌酶的生产流程

鸡蛋清拌和、过虑→环氧树脂预备处理（724孔眼酸性正离子互换环氧树脂获取鸡蛋清液中的溶菌酶，硫酸、氢氧化钠溶液溶液的浓度为1mol/L，泡浸時间均为10h）→吸咐→过柱→超滤技术輔助纯化、除盐→低温干燥得溶菌酶纯品。

1.2.2 加工工艺提升

1.2.2.1 单要素实验

以环氧树脂使用量、鸡蛋清渗沥液pH值、过柱液浓度值、过柱時间为调查要素，测量过柱液中溶菌酶浓度值（mg/mL）及比魅力（U/mg），并以溶菌酶的比魅力（U/mg）为指标值调查阳离子交换的单要素实验結果。

1.2.2.2 Box-Behnken实验

在单要素实验的根基上，挑选环氧树脂使用量（A）、过柱液NaCl浓度值（B）、鸡蛋清渗沥液pH值（C）、过柱時间（D）4个要素，每一个要素选择低、中、高3个水准（表1），选用4要素3水准的回应斜面方式设计方案实验，并以溶菌酶比魅力为指标值，明确最好获取加工工艺。

1.2.2.3 超滤膜实验

将阳离子交换所获得比魅力最大的过柱液，放置不一样转速比、時间下完成离心式超滤膜（截流分子质量为50ku），弃顶层液，所得的下一层液于6500×g，20min离心式开展二步超滤膜（3ku），留顶层提取液，并且以酶成分、比魅力为调查指标值，研究最佳超滤膜标准。

1.2.3 溶菌酶成分及比魅力测定法

1.2.3.1 溶菌酶成分的测量

参照《鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法》（GB/T25879-2010），略微修改。以0.9%NaCl水溶液为对照品液，在光波长281nm处先后测量各溶菌酶规范液OD值，制作标曲。取试件1mL，用0.9%NaCl溶液稀释滴定剂至25mL，搅拌，在光波长281nm处测量试件水溶液的OD值，平行测定3次，由标曲线性回归方程测算样品的溶菌酶浓度值。

1.2.3.2 溶菌酶比魅力的测量

参考《溶菌酶活性检测方法》（GB/T30990-2014），略微修改。于被测管内添加0.4mL被测酶液，再添加2mL溶壁微革兰阴性杆菌菌液后開始记时，在光波长450nm处各自反映15s和75s后，纪录OD值A₁₅和A₇₅。按每分较OD₄₅₀值降低0.001为一个魅力企业（U）界定，测算酶魅力，见式（1）。

式中，E_A—溶菌酶比魅力（U/mg）；E_w—测定酶液中溶菌酶成分（mg）。

1.2.4 溶菌酶相对性酶活的测量

测量溶菌酶在不一样标准下的酶活，计酶活最大值为100%，相对性酶活为在不一样标准下酶活与最大酶活的百分数。

1.2.5 溶菌酶商品纯净度评定

参考Laemmli等的聚正丁酸凝胶电泳法（SDS-PAGE）检验1.2.1节中吸咐溶菌酶的过柱液和超滤膜酶液的纯净度。电泳原理完毕后，应用凝胶成像仪收集图象，ＩmageLab

5.2.1 手机软件剖析图象。

1.2.6 鸡蛋清溶菌酶一部分酶学特性的研究

以1.2.1节中历经提升后制成的溶菌酶为试品酶，研究pH值、溫度、金属离子、表活剂对溶菌酶酶活的危害，及其该酶的环境温度和pH可靠性。

1.2.6.1 pH值对溶菌酶酶活的危害

应用不一样pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的盐水配置成浓度值为20g/mL的酶液，25℃水浴30min后，按1.2.4节上述方式测量相对性酶活（%）。

1.2.6.2 溫度对溶菌酶酶活的危害

应用pH数值7.0的盐水配置成浓度值为20g/mL的酶液，水浴加热至不一样溫度（20，30，40，50，60，70，80℃），隔热保温30min后，测量相对性酶活（%）。

1.2.6.3 溶菌酶的pH可靠性

应用不一样pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的盐水配置成浓度值为20μg/mL的酶液，并各自反映30，60，90min后，测量相对性酶活（%）。

1.2.6.4 溶菌酶的溫度可靠性

应用pH数值7.0的盐水，配置成浓度值为20μg/mL的酶液，水浴加热至不一样溫度（30，40，50，60，70，80℃），隔热保温30，60，90min后，测量相对性酶活（%）。

1.2.6.5 金属离子对溶菌酶酶活的危害

用纯净水配置成浓度值为20μg/mL的酶液，添加等大小的不一样金属离子（Na ，K ，Ca² ，Mn² ，Zn² ，Mg² ）水溶液，使水溶液中最后金属离子成分为0.01mol/L，与此同时设空白试验，25℃水浴30min后，测量相对性酶活（%）。

1.2.6.6 表活剂对溶菌酶酶活的危害

应用pH数值7.0的盐水配置成浓度值为20μg/mL的酶液，等容积添加摩尔分数10%的凡士林、Tween20、Tween40、Tween80，设空白试验，25℃水浴30min后，测量相对性酶活（%）。

1.2.7 数据处理方法

选用Design-Expert8.0.6手机软件响应面设计方案、数据统计分析、回归分析创建，选用OriginPro8.0作图；实验数据信息选用SPSS19.0手机软件开展数据统计分析。

2 結果与剖析

2.1 阳离子交换单要素提升

2.1.1 环氧树脂使用量提升

由图1得知，当鸡蛋清环氧树脂之比10∶2时，溶菌酶比魅力做到最高值14997.78U/mg，以后伴随着环氧树脂成分的提升，溶菌酶比魅力迟缓降低。而酶成分随鸡蛋清环氧树脂比的提高而提升，在鸡蛋清环氧树脂比抵达10∶2.5以后，提升迟缓。由此可见，当鸡蛋清环氧树脂之比10∶2.5时，所得的溶菌酶的比魅力较高，环氧树脂使用量适合，适合获取分离出来溶菌酶。2.1.2鸡蛋清渗沥液pH值提升由图2得知，当鸡蛋清渗沥液pH数值9时，溶菌酶比魅力最大（16048.71U/mg），当pH值太高高或过低时，酶的比魅力都是会有一定的减少，很有可能因为pH值更改了鸡蛋清渗沥液中酶的通电情况，偏酸、过碱都是会对酶构造产生不可逆的毁坏，使酶的比魅力降低。与酶成分做到最高处对比（pH8），pH9时酶成分降低，而比魅力却上升，即阳离子交换纯化鸡蛋清溶菌酶的挑选pH数值9做事后实验。