3結果与剖析

3.1排风管菌的抵抗工作能力剖析

以香烟为宿主，检测排风管菌对由灰红提孢造成的灰霉病，由链格孢造成的赤星病和黑斑病的控制实际效果开展抗病性基因型试验（表3）。结果显示，在石蜡切片和活物标准下，排风管菌可以使灰霉病病斑总面积各自降低91.97%和100%；使赤星病病斑总面积降低77.12%和75.03%。而在黑斑病的对照组中，石蜡切片标准下并没有观查到显著的抗病性实际效果；活物注射病菌时，反复多次未监测到显著病发征兆。

香烟灰霉病、香烟赤星病和香烟黑斑病各自由灰红提孢、链格孢和细极链格孢造成香烟叶子的病斑总面积精确测量后，被用于较为排风管菌对以上三种病虫害的抵抗工作能力数据信息应用单要素方差分析，“*”表明差别明显（P<0.001）。

3.2生物信息学剖析

对该菌种的基因开展剖析，发觉排风管菌该菌种具备11个几丁质酶遗传基因，12个β-1，3-甘酶遗传基因。在其中五个几丁质酶遗传基因（EVM0010419；EVM0005032；EVM0003995；EVM0003825；EVM0009013）和3个β-1，3-甘酶遗传基因（EVM0006890；EVM0003791；EVM00010135）所相对应的蛋白质编码序列N端具备信号肽构造排风管菌几丁质酶遗传基因的传统结构域分析表明，排风管菌几丁质酶遗传基因均归属于GH18基因家族。除此之外，EVM0005032和EVM0003825尾端含有Chic_BD（aromaticchitin/cellulosebindingsiteresidues）构造，归属于B类几丁质酶（CHIB）。

3.3几丁质酶遗传基因和β-1，3-甘酶基因表达谱分析

RT-qPCR剖析僵持塑造第六d的排风管菌植物细胞裂化酶基因表达水准结果显示在该环节，好几个基因的表达量上涨，如几丁质酶遗传基因EVM0005032，EVM0003825和EVM0009013，β-1，3-甘酶遗传基因EVM0006890（图2）。尤其是几丁质酶遗传基因EVM60005032（BaCHIB），在与链格孢、茄链格孢、灰红提孢和尖孢镰刀菌的僵持塑造时，该遗传基因各自上涨表述27.3倍、31.7倍、50.3倍和41.3倍（图2B），但在与链格孢iPhone专化型和细极链格孢相互影响时，该遗传基因未产生对应的上涨表述。整体上看来，除遗传基因EVM0005032外，其他遗传基因上涨的情形主要是聚集在排风管菌与茄链格孢和尖孢镰刀菌的僵持塑造中，如遗传基因EVM0009013和EVM0006890在解决茄链格孢时表述上涨（图2e，2f）。此外，同为B类几丁质酶遗传基因的EVM0003825仅在与尖孢镰刀菌的僵持塑造中发生显著的上涨表述（图2d）。

3.4几丁质酶BaCHIB的抗真菌药活力

应用镍柱对重组蛋白BaCHIB开展了分离纯化，在咪唑浓度值为80mmol/L时目地蛋白质能被高效率过柱，并在之后的SDS-PAGE中表明为单一杂带（图3）。尺寸在50～70kD中间，与预测分析分子结构大小63.6kD相仿。对净化后的重组蛋白开展活力测量，在37℃下几丁质酶活力约为17.7U/mg。

对几丁质酶BaCHIB开展抗真菌药活力检测，经48h温育，相比于对照实验，加上BaCHIB的对照组中，链格孢、茄链格孢和灰红提孢均无新生儿真菌生长发育的印痕，主要表现出突出的生长发育抑制效果。

图2注射6d后排风管菌预测分析具备信号肽构造的植物细胞裂化酶遗传基因相对性表述量分析将排风管菌独立塑造做为对照实验；A1为链格孢；A2为链格孢iPhone专化型；A3为茄链格孢；A4为细极链格孢；B灰红提孢；F为尖孢镰刀菌.依据多重比较結果，不一样英文字母表明差别明显（P≤0.05）。

图3重组蛋白BaCHIB的提纯

4探讨

本分析根据石蜡切片和活体实验，证实了排风管菌对香烟灰霉病和赤星病具备优良的抗病性实际效果。但在香烟黑斑病的石蜡切片浸染4d后，排风管菌使用是否对病发总面积并无显著危害，表明在石蜡切片标准下排风管菌对香烟黑斑病沒有抗病性实际效果，而在活体实验中，对照组和对照实验均没病斑的产生，该状况很有可能因为采用的细极链格孢菌种浸染工作能力较差，造成 浸染后没什么感觉病基因型发生。

生防微生物菌种根据代谢植物细胞裂化酶抑止病菌的发育是其充分发挥生防功效的具体体制之一，如几丁质酶，β-1，3-甘酶，淀粉酶和胰蛋白酶，这种酶体一般在毁坏病原菌的植物细胞中起着非常重要的功效。为了更好地基本研究排风管菌植物细胞裂化酶在排风管菌抗病性中的功效，本分析利用生物信息学和RT-qPCR的方向考虑，对排风管菌一部分植物细胞裂化酶开展剖析。

GH18大家族普遍出现于原核生物，真核生物甚至病毒感染中。依照结构域差别可分成两类：ClassIII（B类）和ClassV（A类）。在其中B类几丁质酶带有几丁质或含糖量融合结构域，这类几丁质酶关键参加细菌成长发育历程中的养分消化吸收，并在纤毛虫和一部分细菌内寄生虫类的环节中起到主要功效。除此之外，此类几丁质酶基因结构与绿色植物几丁质酶遗传基因类似，而后面一种一般与寄主植物对病源病菌，细菌及纤毛虫的抵抗性有关。从而可推断，排风管菌几丁质酶遗传基因EVM0005032（BaCHIB）和EVM0003825很有可能在排风管菌对病源细菌的害虫防治中起到至关重要的分子生物学功效。

图4资产重组几丁质酶BaCHIB的抗真菌药活力三角形标志标示琼脂块，箭头图标标示病源细菌新生儿真菌。

应用RT-qPCR对预测分析具备信号肽构造的几丁质酶遗传基因和β-1，3-甘酶基因表达谱开展深入分析测量，借此机会挑选出很有可能具备抗真菌药活力的植物细胞裂化酶遗传基因。在僵持塑造操作过程中，好几个遗传基因在注射6d后表述量上涨，尤其是，几丁质酶遗传基因EVM0005032。结果显示一部分绿色植物念珠菌性病源，如链格孢，茄链格孢，尖孢镰刀菌和灰红提孢，可以立即诱发排风管菌植物细胞裂化酶基因表达。这一结论与Banani等的科学研究类似，桃梅奇酵母菌（Metschnikowiafructicola）菌种AP47在桃褐腐病原菌（Moniliniafructicola）植物细胞提取液诱发下，其几丁质酶遗传基因MfChi上涨表述14倍，并在之后的试验中体现出水蜜桃褐腐病的明显抑止工作能力。除此之外，Essghaier等在科学研究一种嗜盐菌对草莓灰霉病的预防全过程中，发觉枯草枯草芽孢菌可以代谢各种具备抗真菌药活力的抗氧化物：几丁质酶，β-1，3-甘酶，纤维素酶和胰蛋白酶；Urbina等在其科学研究中也发觉橄榄假丝酵母代谢的一种β-1，3-甘酶对iPhone病菌拓展青霉具备拮抗作用工作能力。以上科学研究为排风管菌几丁质酶BaCHIB具备抗真菌药活力的如果给予了相对的根据。另一方面，同归属于B类几丁质酶的遗传基因EVM0003825，仅在排风管菌与尖孢镰刀菌的僵持塑造中发生上涨表述，而未发生类似BaCHIB在解决多种多样病源细菌时的高表述状况，这一結果表明，几丁质酶遗传基因BaCHIB很有可能在解决病源细菌具备一定的非特异。

融合抗病性实际效果与几丁质酶遗传基因BaCHIB的诱发表述剖析，说明排风管菌对绿色植物细菌病虫害抗病性主要表现与BaCHIB的诱发表述状况的发生高宽比同歩。如排风管菌对香烟灰霉病和赤星病具备抗病性工作能力，几丁质酶遗传基因BaCHIB在与灰红提孢和链格孢的僵持塑造中发生诱发表述；对香烟黑斑病沒有明显的抗病性实际效果，BaCHIB不发生明显的诱发表述。这一結果为几丁质酶遗传基因BaCHIB在排风管菌的害虫防治中起到主要功效给予了又一重要直接证据。

根据真核外源性表述系统软件，排风管菌几丁质酶BaCHIB可以被取得成功表述和提纯。并呈现出几丁质酶活力和较好的抗真菌药活力。这一結果证实了几丁质酶BaCHIB具备抗真菌药工作能力在Ahmed等的分析中，翠绿色木霉几丁质酶在含量为2.23mg/mL时，对尖孢镰刀菌塑造5d后的抗菌工作能力为45%；而另一种来源于珊瑚礁革兰阴性杆菌的几丁质酶，在含量为0.15mg/mL和0.75mg/mL时，对稻瘟病菌分生孢子出芽抑制率各自在40%和10%上下；而来自哈茨木霉的几丁质酶Chit46，在含量为3.9μg/mL时，对灰红提孢塑造5d后的成长抑止工作能力为76%，主要表现出较以上二种几丁质酶更加高效率的抗菌工作能力在本分析中，三种病源细菌在0.2mg/mL的几丁质酶水溶液中塑造2d后，新生儿真菌生长发育被明显抑止，证实排风管菌几丁质酶BaCHIB一样具备不错的抗真菌药工作能力。

本试验结果显示，具备生防工作能力的排风管菌BK-1可能是根据代谢几丁质酶BaCHIB完成其对一些绿色植物细菌病虫害的抑止，但主要的害虫防治体制，依然必须在这个基础上实现更为深层次的科学研究。