海产品口味美味、营养丰富，备受顾客的钟爱，殊不知，海产品非常容易腐坏霉变，导致很大的财产损失。因为微生物菌种的成长和侵入是造成 海产品腐坏的首要要素，因而海产品的储藏全过程中对生物的抑止十分关键。超低温储藏技术性是应用最开始，也是使用最广泛的海产品冷藏技术性。超低温会使微生物菌种的生理学功能产生主要的转变，例如膜流通性减少，核苷酸二级结构可靠性提高，基因表达、汉语翻译及蛋白质伸缩的效果下降等。在较低温度下有一些微生物菌种仍能以一定的发育速度生长发育，即便 生长发育比较慢。腐坏希瓦氏菌是一种耐冷菌，在0℃下也可以生长发育、繁育，其在有氧运动冷藏或冷冻情况下是多种多样海产品的特殊腐坏菌，造成冷冻海产品的腐坏霉变，这明显减少了海产品的质量，极有可能造成 食品卫生安全难题。由于海产品冷藏的关键经济价值，深入了解腐坏希瓦氏菌超低温融入的分子结构体制，能够輔助预测分析腐坏菌在冷冻食品类中的个人行为，有利于开展更确切的风险性预估和预防。

研究发现，微生物菌种在超低温功效下易造成冷应激状态，转化成一系列的抗超低温蛋白质，称之为冷激蛋白质。病菌冷激蛋白质是一类包括核苷酸融合冷休克结构域的高宽比传统的小分子水蛋白质（～7.4ku），能够做为分子伴侣与单链DNA或单链RNA融合，阻拦DNA或RNA在较低温度下产生二级结构，进而推动转录和翻译。除此之外，冷激蛋白质还参加病菌的好几个生理学生物化学全过程，如：细胞质的流通性，病菌一切正常发育与分裂，营养成分威逼，病菌的感病等。冷激蛋白质对病菌在低溫时修复生长发育和充分发挥体细胞各种各样作用是十分关键的，是分析微生物菌种超低温融入体制的重要蛋白质。殊不知，现阶段有关腐坏希瓦氏菌冷激蛋白质的科学研究很少有报导。

病菌一般有着好几个冷激蛋白质，且冷激蛋白质的功效规律性十分复杂，并不是全部冷激蛋白质都受超低温诱发表述。根据对NCBＩ数据库查询中腐坏希瓦氏菌方式菌种的全基因组序列查找，发觉腐坏希瓦氏菌中存有3个典型性冷激蛋白质，现阶段并未看到相关其关键冷激蛋白质及有关作用的科学研究。文中以海产品的腐坏希瓦氏菌为研究对象，根据PCR扩增得到海产品腐坏希瓦氏菌的3个冷激蛋白质基因序列，在这个基础上根据生物信息学剖析腐坏希瓦氏菌冷激蛋白质的理化性质、构造和作用特点等，致力于为冷激蛋白质在腐坏希瓦氏菌超低温融入全过程中的功用科学研究，及其对海产品中腐坏希瓦氏菌的抑止给予参照。

1 原材料与方式

1.1 原材料与实验试剂

腐坏希瓦氏菌为本试验室自腐坏的冷冻大菱鲆中分离出来所得的，于-80℃储藏。聚合酶链反应（Polemerasechainreaction，PCR）引物设计授权委托生工生物工程项目（上海市）技术咨询有限责任公司生成

EasyTaqRDNAPolymerase，北京市都是金生物科技有限责任公司；病菌基因DNA获取检测试剂盒、GeneRed核酸染料，天根生化高新科技（北京市）有限责任公司；Biowest琼脂糖、LB营养成分琼脂粉、LB营养成分骨头汤，青岛市高科园海博生物技术性有限责任公司。

1.2 仪器设备与机器设备

防挥发梯度方向PCR，英国Eppendrof企业；凝胶电泳及配套设施机器设备，英国Bio-Bad公司；少量冷冻离心机，英国Thermo企业。

1.3 菌种鉴定及冷激蛋白质遗传基因的复制与转录组测序

活性本试验室储藏的腐坏希瓦氏菌，依照基因DNA获取检测试剂盒的操作流程获取基因DNA，运用病菌16SrRNA遗传基因通用引物27F和1492R开展PCR扩增，得到腐坏希瓦氏菌的16SrRNA遗传基因（表1）。选用NCBＩ查找近缘腐坏希瓦氏菌菌种基因信息内容（GenBank：CP002457.1），根据注解冷激蛋白质遗传基因以及上、中下游编码序列，设计方案引物设计（表1），开展冷激蛋白质的Csp1589，Csp1376和Csp2252遗传基因的增加。PCR扩增标准为94℃5min；94℃30s，Tm℃30s（详细表1），72℃45s，循环系统三十次。PCR物质经2%的琼脂糖电泳电泳原理检验后送至上海生工转录组测序。

1.4 系统软件产生树的搭建

自NCBＩ数据库查询得到大肠埃希菌（NC_000913.3）的9个冷激蛋白质（CspA～Ｉ），以FASTAfile方式储存。根据手机软件ClustalX对转录组测序所得的腐坏希瓦氏菌冷激蛋白质和大肠埃希菌的冷激蛋白质开展序列比对，并且用Mega7.0中的临接法（Neighbor-jioningmethod，NＪ）为其搭建系统软件产生树，步幅值（Bootstrapvalues）为1000。

1.5 冷激蛋白质的理化性质及结构域的预测分析

ExPASy网址中的一个专用工具ProtParam来预测分析腐坏希瓦氏菌冷激蛋白质的基本上生理学、生物化学特点，用PSORTwwwServer中的PSORTPrediction专用工具预测分析冷激蛋白质体细胞精准定位，用TMHMMServer2.0预测分析冷激蛋白质跨膜地区，用SignalＩP5.0线上预测分析冷激蛋白质信号肽，用SMART预测分析冷激蛋白质结构域的产生以及其作用，用在线软件NCBＩConservedDomainSearch开展其碳水化合物保守序列剖析。

1.6 构造预测分析与实体模型品质评定

应用PSＩPRED预测分析腐坏希瓦氏菌冷激蛋白质的二级结构。将腐坏希瓦氏菌冷激蛋白质的氨基酸序列递交到SWＩSS-MODEL网址开展三级构造的预测分析。将搭建的蛋白质三级实体模型用PROCHECK和Ｖerify3D开展品质评定。PROCHECK和Ｖerify3D是SAＶESv5.0中的构造评定服务项目。

1.7 互作蛋白质及配位融合结构域的预测分析

用STRＩNG专用工具明确在活身体与腐坏希瓦氏菌冷激蛋白质存有相互影响的蛋白质。这类相互影响既包含蛋白中间立即的物理学相互影响，也包含蛋白中间间接性的作用关联性。将从SWＩSS-MODEL获得的模式文档键入COACH，以预测分析腐坏希瓦氏菌冷激蛋白质潜在性的配位融合结构域。