1.3.6 生物膜系统产生工作能力的测量

参考KuSada等的方式 ，选用结晶紫染色法剖析蒜头提取液对病菌生物膜系统产生工作能力的危害。将病菌细胞培养液按1∶1000的比率稀释液，添加无菌检测96填料中，添加不一样含量的大蒜提取物（终浓度值为0.15～1.20mg/mL），30℃静放塑造24h。清除细胞培养液，用无菌检测双蒸水清洗3次，无菌检测风干躁，添加200μL0.1%结晶紫上色液，室内温度上色15mIn，无菌水清洗3次，添加1mL95%酒精浸洗生物膜系统，将洗剂于光波长570nm处测量OD值。

参考PackIavaThｙ等的方式 ，运用激光共聚焦光学显微镜（cLSm）剖析病菌生物膜结构的转变。将病菌细胞培养液按1%的占比连接含1mLLB培养基的24填料中，添加1.20mg/mL大蒜提取物和直徑为1cm的环形盖玻片，静放塑造24h。用无菌水轻轻地清洗装片上未黏附的体细胞，0.1%吖啶橙上色1mIn。洗去不必要的上色液，将盖玻片置显微镜下观查。该光学显微镜配有激起光波长为515～560nm的激起滤光器及60×（60倍）的油镜，其光学显微镜相片与电镜相片均由FluovIewv5.0手机软件得到

1.3.7 基因的表达量的测量

选用即时荧光定量PcR（RT-PcR）技术性。病菌活性后添加1.20mg/mL大蒜提取物塑造24h，运用病菌RnA获取检测试剂盒获取病菌RnA。在20μL反映系统中，添加10μL2×荧光定量PcR预混管理体系，0.4μL10μmol/L上、中下游引物设计，2μLcDnA模版。PcR增加程序流程为：预转性95℃3mIn，转性95℃7S，淬火57℃10S，拓宽72℃15S（45个循环系统）。相对性表述量（RQ）由2-ΔΔcT方式测算得到。

1.3.8 病菌腐坏工作能力的测量

参考Zhao等的办法制取无菌检测鱼浆汁水。冷藏鱼浆解除冻结后，按质量比1∶1放水磨浆，加温烧开5mIn后静放，制冷至室内温度。用2层沙布过虑得鱼浆汁水，添加1.6g/L氧化三甲胺、40mg/LL-胱胺酸和40mg/LL甲硫氨酸，混和匀称后于121℃高压灭菌15mIn，得无菌检测鱼浆汁水。无菌检测情况下，在鱼浆汁水中加入不一样浓度值的大蒜提取物（终浓度值为0.15～1.20mg/mL）。将制作好的病菌菌悬浮液注射至无菌检测鱼浆汁水中，于30℃中摇床塑造48h，每间距6h抽样，测量鱼浆汁水中TVB-n和腐胺成分转变 。

TVB-n的测量参考赵丹丹等的方式 ，取5mL试品，添加15mL0.6mol/L高氯酸水溶液匀质搅拌，上清液用全自动凯氏定氮仪测量。腐胺成分的测量参考Zhao等的方式 ，取2mL试品，添加25mL0.4mol/L高氯酸水溶液匀质搅拌，上清液用丹磺酰氯衍化后用高效液相色谱色谱。

1.4 数据信息数据分析

应用SPSS21.0手机软件和OrIgIn8.5手机软件分析数据。测量結果以平均值±标准偏差（n≥3）表明，选用最少明显差别法（LSD）开展显著性差异剖析，显著性检验为5%。

2 結果与剖析

2.1 维氏气单胞菌产AHLs信号分子的类型

以根癌农杆菌为汇报菌，运用平行面划线法剖析维氏气单胞菌的AHLS分子结构造成状况，結果见图1。病菌形成的AHLS可根据琼脂粉蔓延诱发根癌农杆菌造成β-半乳甘酶，并溶解底物X-gal造成深蓝色黑色素。由图1得知，维氏气单胞菌可造成AHLS类信号分子并诱发根癌农杆菌显深蓝色。

根癌农杆菌对不一样碳链的长度或含有不一样官能团的AHLS分子结构比较敏感层度不一样，这种AHLS经TLc进行，在培养液相对应的部位诱发根癌农杆菌展现深蓝色色斑。依据色斑的比移值、样子和色调深、浅可直接分辨AHLS的类型及相对性成分。对维氏气单胞菌的AHLS萃取液的TLc剖析結果见图2。剖析得知，该病菌最少造成3种AHLS分子结构，即：c6-HSL、c7-HSL和c8-HSL。c4-HSL与c6-HSL是现阶段气单胞菌属报导数最多的2种AHLS信号分子。LI等在腐坏比目鱼中分离出来的柔和气单胞菌中检查到c4-HSL、c6-HSL、c8-HSL、N-癸酰基-高丝氨酸内酯（c10-HSL）和n十二酰基-高丝氨酸内酯（c12-HSL）。本实验在维氏气单胞菌中检查到主链上的氧原子数量为质数的AHL信号分子，即c7-HSL。

2.2 维氏气单胞菌生长发育历程中AHLs活力转变

病菌形成的AHLS分子结构浓度值受病菌相对密度转变 危害，不一样发育环节的病菌AHLS萃取液能诱发根癌农杆菌造成不一样孔径的深蓝色圈。维氏气单胞菌生长发育历程中的病菌数量与细胞培养液PH值的转变 见图3，AHLS活力转变 见图4。剖析得知，尿培养4h时处在多数成长期前期，这时病菌代谢的AHLS可诱发根癌农杆菌显深蓝色。在4～10h病菌的迅速成长环节，根癌农杆菌的掉色直徑持续扩大，表明AHLS的成分迅速积累。在10～18h时，根癌农杆菌深蓝色圈的孔径较大 ，这时细胞培养液中AHLS浓度值最大。在18～48h，病菌处在生长发育稳定型，诱发汇报菌掉色的直徑减少，表明AHLS的浓度值逐渐减少。研究发现，AHLS成分的降低与自然环境PH值上升相关。AHLS的高丝氨酸内酯环在偏碱情况下构造不稳定，易解环。对病菌生长发育历程中细胞培养液的PH值转变的分析表明：尿培养18h后细胞培养液的PH值由6.92升至8.11，塑造48h时PH值达8.97。伴随着病菌的生长发育，细胞培养液的PH值持续上升，AHLS逐渐溶解，活力减少。

2.3 维氏气单胞菌的遗传基因剖析

革兰氏阳性菌阴性菌AHLS受体的人群磁感应系统软件主要是由luxRI的同源基因管控。运用PcR技术指标分析维氏气单胞菌中的luxRI同源基因，結果见图5a。剖析发觉2个精彩片段编码序列各自为基因表达管控因素AcuR和自诱发遗传基因AcuI，这与ＪangId等的分析結果同样，该专家学者初次在维氏气单胞菌mTcc3249中检查到AcuRI人群磁感应系统软件。除此之外，剖析维氏气单胞菌的碳水化合物脱羧酶遗传基因和感病遗传基因，結果见图5b、5c。鸟氨酸脱羧酶遗传基因（ODC）和磷酸氢钙脱羧酶遗传基因（LDC）的验出表明该病菌具备产腐胺和尸胺的工作能力，胞内酶遗传基因（AhyB，ser，liP）的验出表明该菌具备一定的胰蛋白酶活力和淀粉酶活力，微绒毛遗传基因（flA）的验出表明该菌具备微绒毛健身运动和产生生物膜系统的工作能力。

2.4 大蒜提取物对维氏气单胞菌产AHLs的抑制效果

大蒜提取物对维氏气单胞菌的最少抗菌浓度值为2.5mg/mL（数据信息未表明）。本实验挑选小于此浓度值的系列产品（0，0.15，0.3，0.6，1.2mg/mL）来科学研究大蒜提取物对维氏气单胞菌人群磁感应的影响功效。

根据检验微生物汇报菌根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶促反应来剖析不一样浓度值大蒜提取物对维氏气单胞菌造成AHLS活力的影响功效，結果见图6。剖析得知，伴随着大蒜提取物浓度值的提升（0～1.20mg/mL），根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶促反应持续减少（P＜0.05）。这表明大蒜提取物对维氏气单胞菌产AHLS活力具备明显的抑制效果（P＜0.05），且大蒜提取物的浓度值与其说人群磁感应抑止活力呈显著量效关联。大蒜提取物浓度值为1.20mg/mL时对根癌农杆菌的β-半乳甘酶活力的抑制率最大，为39.6%。这有可能是由于此浓度值下维氏气单胞菌AcuR蛋白质与人群磁感应抑止活性物质的结合性最強，抑止了AHLS分子结构的基因表达表述。