甜叶菊（SteviarebaudianaBertoni）属多年生长 菊科木本植物，原产地于非洲地区和墨西哥的高山草甸，尤其是南美洲巴拉圭东北部地区。甜叶菊中含有甜菊糖苷，被普遍作为纯天然甜味素。有科学研究报导从甜菊提取液中评定出89种化学物质，并将其划分为多酚类、三萜类、碳水化合物化合物、油酸以及化合物类、低聚木糖、糖脂质、漂呤和维甲酸等。这种化学物质具备各种生物活性，如抗氧化性，抗菌，抗癌等。甜菊提取液中的花青素和黄酮类化合物、多糖类化学物质具备较强的身体之外降低胆固醇的工作能力。殊不知，有关甜叶菊提取液身体抗氧化性活力的科学研究很少有报导。在生产制造甜菊糖苷的环节中会形成很多的斜板沉淀池废料，在其中富含大量的的多酚类，而这种副产品并未获得灵活运用。科学研究甜叶菊废料提取液的抗氧化性、延缓衰老功效，对充足综合利用甜叶菊資源有着关键实际意义。

本探讨选用高效液相色谱色谱分析（HPLC）对二种甜叶菊废料提取液中的主要成分开展定性分析，并检测其对D-半乳糖致变老小白鼠血清蛋白、肝部和脑部中一些主要的抗氧化性指标值（如超氧化物歧化酶（SOD）、硫辛酸乳酸脱氢酶（GPx）和丙二醛（MDA），及其脑部中Nrf2以及靶遗传基因（SOD1，GPx1，HO-1）的mRNA表述能力的危害等，讨论甜叶菊废料提取液对D-半乳糖致变老小白鼠的抗氧化性功效，为其进一步开发设计和使用给予理论来源。

一、原材料与方式

1、实验原材料

二种甜叶菊废料提取液，晨光生物高新科技控股集团有限责任公司。

2、动物实验

SPF级昆明市种男性小白鼠（33～37g，SPF级，8周龄），军事医学科学院动物实验核心，小动物合格证书号：SCXK-（军）2012-0004。

3、关键实验试剂

D-半乳糖（分析纯级），国药控股化学药品有限责任公司；茶氨酸（茶氨酸＞88%、EGCG＞40%、儿茶酸=0.76%），成都市华高生物制药有限责任公司；咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、原儿茶醛、槲皮苷（纯净度均≧98%），成都市瑞芬斯生物技术有限责任公司；超氧化物歧化酶（SOD）、硫辛酸乳酸脱氢酶（GPx）、丙二醛（MDA）测定试剂盒，南京建成生物技术研究室；BCA法蛋白定量检测试剂盒、高纯度总RNA迅速获取检测试剂盒（离心式柱形），北京市百泰克生物科技有限责任公司；FastQuantcDNA第一链生成检测试剂盒（去基因），天根生化高新科技（北京市）有限责任公司；工业甲醇（色谱仪级），北京市迈瑞达高新科技有限责任公司；其他实验试剂均为国内分析纯级。

4、仪器设备与机器设备

Agilent1290超高效率液相色谱仪，英国安捷伦科技有限责任公司；DY89Ⅱ匀浆机，宁波新芝生物技术有限责任公司；SpectraMax13持续光波长多用途酶标仪，英国MolecularDevices企业；3K15台式离心机，法国Sigma企业；S1000PCR扩增仪、CFX96荧光定量PCR仪，英国伯乐相马企业；NanoDropTM2000少量紫外线-能见光光度计，英国赛默飞世尔企业。

5、实验方式

（1）二种甜叶菊废料提取液中主要成分的定性分析

本试验室分析工作人员早期科学研究确认，甜叶菊废料提取液的主要成分为咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、原儿茶醛和槲皮苷。选用HPLC法对二种甜叶菊废料提取液中的主要成分开展定性分析。高效率液相色谱仪标准为：AgilentEclipsePlusC18色谱柱（50mm×2.1mm，1.8μm），流动性相为0.1%苯甲酸（A）和工业甲醇（B），流动速度0.1mL/min。过柱程序流程：0～10min，10%～50%（B）；10～12min，50%～10%（B）；12～15min，10%（B）。检验光波长320nm和360nm，柱温30℃，进样量1μL。选用咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、原儿茶醛和槲皮苷为标准物质，按以上色谱仪标准各自测量。以标准物质的质量摩尔浓度为横坐标轴，峰总面积为纵轴，制作HPLC标曲，并测量二种甜叶菊废料提取液中各主要成分的成分。

（2）甜叶菊废料提取液对D-半乳糖致变老小白鼠的抗氧化性功效

①小白鼠喂养标准

小白鼠喂养于北京食用添加剂工程设计研究所，自然通风标准优良，一切正常白天黑夜转变（9:00-21:00），空气湿度（40±5）%，室内温度（21±2）℃。

②试验排序及实际操作

80只试验小白鼠融入7d，喂养一般精饲料，随意饮用水、寻食。稳定期后，任意等分成一切正常组、D-半乳糖组、二种甜叶菊废料提取液低、中、高使用量组（各自灌胃100，200，500mg/kgbw甜叶菊废料提取液），每一组10只，与此同时用苦味酸对小白鼠开展序号。每组在灌胃的与此同时，D-半乳糖组和甜叶菊废料提取液组，颈后背皮内注射5%的D-半乳糖水溶液（500mg/kgbw），一切正常组注入等大小的盐水。每日给药1次，延迟时间为11周。

③被测样版制取

试验完成后，小白鼠忌食（禁不住水）11h。11h后，小白鼠摘目光采血，全血搜集于整洁的1.5mL离心管架中，37℃水浴15min，4000×g离心式15min分离出来血清蛋白，-80℃储存被测。取血后，将小白鼠断颈处决并解剖学，取下肝部和脑部并将其在急冷的盐水中浸洗，除去血夜，用过滤纸吸走表层水份。将肝部和脑部一部分放进小离心管架里，马上放进液态氮（-196℃）中冷冻，转到超低温冰箱（-80℃）储放，预留。另一部分剪下来，添加9倍0.9%急冷的盐水，置夹层玻璃匀浆器中冰水浴快速碾磨做成机构匀浆，4℃，12000×g离心式15min，取上清液，-80℃储存预留。

④血清蛋白及机构抗氧化性指标值的测量

测量血清蛋白、肝和脑部匀浆中SOD，GPx魅力及MDA成分，检验方式 具体步骤按检测试剂盒表明开展。

⑤莹光定量PCR检验小白鼠脑mRNA表述水准

选用高纯度总RNA迅速获取检测试剂盒获取每组小白鼠脑部中总RNA，应用NanoDropTM2000少量紫外线-能见光光度计检验其一致性以及浓度值。按逆转录检测试剂盒操作指南，将获取的RNA逆转录成cDNA并放置-20℃储存。根据SYBRGreen法开展荧光定量，反映管理体系以下（20μL）：无RNA酶水7.4μL，SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）10μL，上中下游引物设计各0.8μL，cDNA模版1μL。RT-PCR反映标准：94℃预转性3min，94℃转性30s，60℃淬火30s，72℃拓宽1min，40个循环系统。以β-actin为内参基因开展即时莹光定量PCR剖析。计算方式选用较为CT值法。涉及到的引物设计编码序列见表1。

(3）数据信息数据分析

选用SPSS20.0统计分析软件，实验数据信息以平均值±相对标准偏差（Mean±SD）表明，用单要素方差分析（one-wayANOVA）及多重比较（Duncan）开展差别显著性分析，P＜0.05为差别明显。

申明：文中常用照片、文本来源于《中国食品添加剂》，著作权归原作全部。