作为一种必需的微量元素，锌对人体的生长发育和免疫系统功能的完善尤其重要。由于体内没有专门的锌储藏点，机体需要通过日常膳食额外补充足够的量来维持体内锌的平衡状态。目前全世界发达国家中大约有22亿人口受到锌缺乏的影响，尤其是婴儿、孕妇、哺乳期的女性以及老年人受影响最严重。因此，促进膳食中锌的吸收成为当前营养研究的热点。

锌在人体内的生物利用度很大程度上取决于其在小肠内的吸收。食物基质中的成分，例如植酸、多酚、皂苷和纤维素等，会与锌结合形成不溶性的复合物，从而阻碍锌的吸收，导致人体锌缺乏。食物中其他矿物质，如铁、钙、铜离子也会竞争性地与载体结合而抑制锌的吸收。通过补充无机盐(ZnSO₄，ZnO)是一种常见的预防锌缺乏的手段，但是含锌的无机盐不仅会改变食物的理化和感官性质，还会引起胃肠道不适，不宜长期摄入。有关食源性多肽作为配体与锌结合，从而提高锌的吸收在国内外已有研究，多肽被认为是一类非常有潜力的促进锌吸收的物质。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，约占总蛋白的80％，是多种生物活性肽的来源；其中，酪蛋白磷酸肽已经被证明能够与锌结合，并且具有很好的促锌吸收效果。但是由于肽一锌螯合物在胃肠道内稳定性的问题，导致锌的消化吸收和在体内的生物利用率有很大差异。鉴于锌离子带有正电荷，肽的结构性质尤其是电荷性质(正负性和净电荷量)，通过静电相互作用，对其螯合锌离子的能力以及螯合物在胃肠道内的稳定性至关重要，会影响锌的最终吸收和生物利用率。但是，目前关于肽的电荷性对肽一锌螯合物在胃肠道内消化和吸收影响的系统研究缺乏报道。

因此，本实验以酪蛋白为原料，经碱性蛋白酶水解后采用阳离子交换柱层析分离酪蛋白肽，并制备肽-锌螯合物。实验中对分离得到的酪蛋白肽的掌电势以及氨基酸组成进行测定，同时采用体外胃液-肠液-Caco-2细胞的三段式消化吸收模型模拟肽-锌螯合物的胃肠消化和吸收，以锌离子的透析率为主要评判指标，考察肽的电荷性质对肽-锌螯合物胃肠消化稳定性和锌生物利用率的影响，结果有望为酪蛋白肽在补锌保健品行业的应用提供参考。

一、实验材料与设备

1、实验材料

酪蛋白(产品编号：C3400)，碱性蛋白酶(Alcalase，P4860=2.4U/g)，胃蛋白酶(P7000=250U/mg)，胰酶(P1750，4XUSPspecifications)，异硫氰酸苯酯(PITC，P1034)，三乙胺(Triethylamine，T0886)，17种氨基酸混合标准品(AASl8)购买于Sigma公司；高糖培养基(DMEM)，胎牛血清(FBS)，非必须氨基酸(NEAA)，青霉素-链霉素混合液，HBSS(Hank’Sbufferedsalinesolution)，胰酶-EDTA购买于Hyclone公司(ThermoScientific)；25cm²细胞培养瓶(Nunc)，6孔Transwell细胞培养板(Nunc，孔径0.4μm，面积4.2cm²)，透析袋购买于北京索莱宝公司；ZORBAXSB-C18色谱柱(250×4.6mm，安捷伦)；SephadexC25凝胶柱层析填料，购买于GEHealthcare生命科学有限公司；Caco-2细胞，购买于中国科学院上海细胞库；其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

2、实验仪器

LC-15高效液相色谱仪、AA-7000原子吸收分光光度计，购于岛津国际贸易(上海)有限公司；HZS-HA恒温水浴振荡器、DL-CJ-1N超净工作台，购于哈尔滨东联电子技术开发有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，购于上海亚荣生化仪器厂；BT-100B数显恒流泵、HD-5电脑紫外检测仪、HD-A电脑采集器，均购买于上海青浦沪西仪器厂；Nano-ZS90纳米粒度电位仪，购买于英国Malvem公司；Infinite200Pro多功能酶标仪，购买于瑞士TecanTradingAG；3111型二氧化碳培养箱，购于ThermoScientific；LGJ-18冷冻干燥机，购于北京四环科学仪器厂。

二、实验方法

1、酪蛋白水解

将酪蛋白固体粉末溶于去离子水中，使其浓度为5％(w/v)，用0.5MNaOH调节pH为8.0，将酪蛋白溶液在60℃水浴中预热10min。随后向其中添加碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为酪蛋白质量的2％，在60℃水浴摇床中酶解4h，在酶解过程中利用0.0lMHCI和0.5MNaOH控制水解液pH为8.0。酶解结束后，将水解液煮沸灭酶15min，冷却至室温后，用0.01MHCI和0.5MNaOH调pH至7.0，随后在4℃8000r/min条件下离心15min，然后取上清液浓缩后冷冻干燥，-80℃低温保存。

2、酪蛋白肽的分离

将上述制备得到的酪蛋白水解物复溶于20mM，pH4.0的醋酸缓冲溶液中，使其浓度为400μlg/mL，充分溶解后，采用0.45μm水系滤膜过滤，滤液经SephadexC25凝胶柱层析进行分离。在0～120min内，采用醋酸缓冲溶液(20mM，pH4.0)作为洗脱液进行洗脱；120～240min内，采用醋酸缓冲溶液(20mM，pH4.0)+0.5MNaCI作为洗脱剂进行洗脱。整个洗脱过程中，控制蠕动泵的流速为3.0mL/min。洗脱液采用紫外检测器检测，波长为220nm，采用系统自带的HD-A色谱处理系统记录分离过程中图谱的变化，根据监测到的样品峰进行样品收集。收集得到的酪蛋白肽组分经旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥，一80℃避光保存。

3、酪蛋白肽组分的ζ电势测定

酪蛋白肽组分ζ电势采用电位分析仪进行测定。酪蛋白肽溶于去离子水中，充分混匀后使其浓度为1mg/mL。随后利用纳米粒度电位仪对分离得到酪蛋白肽组分的ζ电势进行测定，分析时毛细管样品池需在25℃条件下平衡120S。

4、氨基酸组成分析

准确称取2g待测样品于具塞玻璃试管中，然后加入2.0mL6M的盐酸，随后在110℃烘箱中进行全水解24h。水解结束后，在40℃烘箱中烘干。随后用去离子水进行溶解，使其浓度为2mg/mL，取200此于棕色瓶中，向其中添加100μL0.1M的异硫氰酸苯酯和100μL1M的三乙胺，旋涡振荡后，放置于室温黑暗条件下反应1h。反应结束后，向上述反应体系中加入400μL正己烷，旋涡振荡混匀，静置10min后吸取下层液体，过0.22μm水系滤膜后进行高效液相色谱分析。液相条件如下，流动相A：10mM，pH6.9的磷酸缓冲液；流动相B：乙腈。洗脱梯度：1～5min，5～10％B；5～25min，10～21％B；25～45min，21～35％B；45～48min，35～100％B；48～50min，100％B；50～58min，100～5％B；58～60min，5％B。

流速：1.0mL/min，检测波长：254nm，进样量：5μL。采用与上述相同的方法对氨基酸标准品进行测定，然后以浓度对峰面积作出氨基酸标准品曲线。每种氨基酸的含量表示成g/100g。

5、锌螯合能力测定

酪蛋白肽的锌螯合能力的测定参考Jakob等的方法。将样品溶于40mM羟乙基哌嗪乙磺酸-KOH缓冲溶液中(pH7.5)，使其浓度为1Mg/mL。取250mL样品溶液与125μL8mM的二硫苏糖醇和125μL250μM的ZnS0₄+7H20混合，充分混匀后在37℃条件下反应10min，随后向其中加入25μL2mM的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚，混匀后在500nm处测定吸光值。同时以不加酪蛋白肽样品作为空白组，以EDTA作为阳性对照组进行试验。锌螯合能力的计算公式如下：

C=[(A_空白一A_样品)/A_空白]×100。

6、肽-锌螯合物的制备

将ZnS0₄·7H₂0溶于pH7.0的磷酸盐缓冲液中，浓度为50μM，随后将酪蛋白肽溶于上述溶液中，使其终浓度为10mg/mL，混匀后，在室温下搅拌反应1h。随后，用分子截留量为500Da的透析袋透析5h，去除反应液中的游离锌，收集透析袋内的保留物冷冻干燥后得到肽-锌螯合物。

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