1.2.4 摇瓶发酵生产CAD及蛋白质检测

将-80℃保存的重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB以体积分数0.2％接种至含20μg/mL四环素的LB液体培养基中,恒温摇床37℃、200r/min扩大培养8～10h，再以体积分数5％转接至含20μg/mL四环素的TB发酵培养基中，恒温摇床37℃、200r/min培养2～3h后分别加入一定浓度的PLP、PL、PN，于恒温摇床33℃、200r/min进行重组蛋白质的表达。发酵过程中在不同时间取样，测0D₆₀₀。12000r/min离心1min得到菌体和发酵上清液。将菌体用1mL、50mmol/L、pH5.0的Na₂HP0₄-柠檬酸缓冲液重悬，加入0.6mg/mL溶菌酶，在37℃反应30min后置于冰水中超声破碎，12000r/min离心5min得到破壁上清液和破壁沉淀，使用SDS-PAGE检测其蛋白质。

1.2.5 重组CAD酶活测定底

物溶液配制：0.1mol/L-水谷氨酸钠和0.15mmol/LPLP溶于50mmol/L、pH4.5的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液中，置于4℃避光保存。

反应体系：将装有360uL底物溶液的1.5mLEP管于37℃水浴锅预热10min后，加入40uLGAD粗酶液，在37℃下反应4min后，加入600uL、0.2mol/L、pH10的硼酸缓冲液终止反应，置于沸水中灭活10min。

GABA生成量测定：采用HPLC-OPA氨基酸柱前衍生法检测GABA生成量。

酶活定义：在反应液中，1min催化底物转化生成1umolGABA所需的酶量为一个活力单位(U)。

本文中重组GAD均指重组菌所产的GAD。

1.2.6 重组菌全细胞制备GABA工艺流程

1) GABA的制备

水配制质量浓度为127g/L的一水谷氨酸钠底物(折算成100g/L谷氨酸，以下均以折算后的谷氨酸质量浓度进行阐述)。在150mL三角锥形瓶中加入20mL底物，加入一定量的湿菌体(在55℃水浴锅预处理50min，改善细胞膜的通透性)，反应过程中，每隔2h用0.6mol/L的H₂SO₄和NaOH调节pH，使其始终与初始pH一致。在一定温度、pH下，150r/min水浴摇床中反应一段时间，终止反应后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。

2) GABA生成量的测定

将过滤好的样品通过HPLC检测GABA生成量。HPLC色谱条件如下：Agilent1200HPLC色谱仪、Agilent自动进样器、GLInertsilODS-3液相柱、Agilent紫外检测器。流动相A：准确量取995mL纯净水，加入4.52g无水乙酸钠，搅拌使其充分溶解，再加入5mL四氢呋喃和0.2mL三乙胺，之后用冰乙酸调节pH至7.20±0.05，充分混合后用0.22μm无机纤维素滤膜过滤备用：流动相B：准确量取200mL纯净水，加入4.52g无水乙酸钠，搅拌使其充分溶解，用冰乙酸调节pH至7.20±0.05后，再依次加入400mL色谱纯的乙腈和甲醇，用冰乙酸调节pH至7.20+0.05，混合后用0.22μm有机尼龙滤膜过滤备用。梯度洗脱，流量为0.8mL/min，柱温为40℃。根据吸收峰面积和GABA标准品峰面积计算GABA生成量，计算公式如下：

式中：Y为GABA转化率，％；4为谷氨酸转化生成GABA的实际质量浓度，g/L；T为谷氨酸转化生成GABA的理论质量浓度，g/L。

2 结果与讨论

2.1 产谷氨酸脱羧酶重组菌的构建

以实验室保存的质粒pET-24a(+)-gadB为模板，扩增gadB目的片段，并以质粒载体pHY300PLK为模板，扩增表达载体片段。扩增得到的产物用琼脂糖凝胶电泳检测，目的基因片段gadB和质粒表达载体pHY300PLK长度约为1428bp和5731bp，与理论碱基大小一致。验证正确后通过ExnaseⅡ连接酶将两个基因片段连接再转入E.coliJMl09感受态细胞，涂布到LB固体培养基(含氨苄青霉素抗性)后挑取单菌落至LB液体培养基(含氨苄青霉素抗性)中过夜培养。提取质粒，酶切验证和测序成功后，将重组质粒用电击转化法导入表达宿主B.subtilis并涂布到LB固体培养基(含四环素抗性)，之后挑取单菌落至LB液体培养基(含四环素抗性)中培养8～10h，提取质粒后进行酶切验证分析。结果见图3，分别在5130bp和2100bp处有明显的条带，说明重组表达质粒pHY300PLK-gadB在B.subtilis中构建成功。

2.2 分别添加辅酶及辅酶前体对重组菌摇瓶发酵的影响

2.2.1 添加不同种类辅酶及辅酶前体对重组菌产酶情况的影响

种类辅酶及辅酶前体对重组菌产酶情况的影响重组菌按照1.2.4进行摇瓶发酵产酶，摇瓶发酵温度33℃，在重组菌发酵过程中分别添加辅酶PLP(简称GAD-PLP)、辅酶前体PL(简称GAD-PL)和PN(简称GAD-PN)至终浓度为0.5mmol/L。发酵结束后12000r/min离心1min获得菌体，用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎，12000r/min离心5min得到GAD粗酶液。结果见图4，诱导48h后，酶活分别达到25.40、28.14U/mL和15.55U/mL，是对照GAD-0酶活(16.34U/mL)的1.55、1.72和0.95倍。由此可知，添加0.5mmol/LPN时，酶活相较于对照并无明显区别，这是因为枯草芽孢杆菌中缺少PdxH氧化酶，无法通过PLP补救途径将PN转化为PLP，从而提高GAD酶活力。其次随着诱导培养时间的延长，细胞内合成的少量PLP被自身吸收并消耗而无法满足GAD表达水平提高的需要。然而向培养基巾添加适量的PLP或PL可以直接或问接通过PLP补救途径合成PLP，从而提供能够维持GAD稳定的辅酶PLP，促进GAD的折叠，提高酶活。鉴于PLP成本高于PL，所以在发酵过程中选择添加PL进行后续实验。

2.2.2 不同吡哆醛浓度对重组菌产酶情况的影响

重组菌按照1.2.4进行摇瓶发酵，在过程中添加不同浓度的PL(0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.2、0.3mmol/L)发酵培养48h后，12000r/min离心1min获得菌体，超声波细胞破碎机进行细胞破碎，12000r/min离心5min得到GAD粗酶液，结果见图5。随着PL浓度的增加，GAD酶活也随之提高，当PL浓度为0.1mmol/L时，GAD酶活达到最高为28.28U/mL。继续增加PL的浓度，酶活并未发生显著变化，故可知PL的最适添加浓度为0.1mmol/L。图6为发酵过程中添加不同浓度PL后的重组GAD蛋白质电泳图，从图中可见在相对分子质量53000的条带附近有一条清晰的蛋白质电泳条带，符合GAD理论蛋白质相对分子质量大小。

2.2.3 添加吡哆醛前后重组菌发酵过程比较

重组菌按照1.2.4进行摇瓶发酵，在过程中添加0.1mmol/LPL，探究其在不同发酵时间(0、12、24、36、48、60h)对重组菌生长(见图7)和产GAD情况(见图8)的影响。与GAD-0相比，在发酵时问36h左右，PL对菌体的生长有一定的促进作州，是因为存蛋白质表达过程中，通过PLP补救途径，PdxK激酶将PL磷酸化形成PLP，促进GAD的折叠，一定程度上有利于菌体生长。随着发酵时问的延长，南于PLP稳定性差而失去作用,导致菌体的生长有所下降。由图8可知，与GAD-0相比，GAD-PL酶活最高达到28.28U/mL，添加适量的PL可以提供给GAD未知浓度的PLP，从而提高GAD酶活。

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