为建立一种以水合茚三酮为显色剂准确定量检测γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)的方法，本文系统研究了显色酸度、显色剂用量、加热温度和时间等显色条件对水合茚三酮与GABA显色反应的影响，并在最优条件下对该方法进行了评价。结果表明，在pH=7.0时，GABA与1.8 g·L^-1茚三酮乙醇溶液沸水浴60 min后显色稳定。显色后在567 nm处的吸光度与GABA的浓度线性关系良好(y=0.01234x-0.00113，R2=0.99983)。该方法重现性好(RSD=0.06%)，准确度较高(加标回收率为95.4%～117.6%)，检出限达21.6μg·L^-1，对GABA有一定的选择性。对食品添加剂中的GABA用薄层色谱分离后进行显色测定，结果满意。

近年来，随着孤独症、抑郁症、精神分裂症等精神类疾病对生命健康和幸福指数的威胁逐渐增长，有关精神类疾病的预防、诊疗和致病机理的研究受到日益广泛的关注。精神类疾病致病原因复杂，但大多数中枢神经类疾病都与神经递质浓度的变化相关。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)是哺乳动物体内一种重要的抑制类神经递质，主要存在于大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中，介导了40%以上的中枢神经抑制性信号。GABA作为一种重要的药食同源的非蛋白质氨基酸，具有延缓大脑衰老、降低血压、增强免疫力、活化肝肾、增强记忆力和抗焦虑等功效。研究表明GABA对抑郁症、孤独症、精神分裂症、脑血管病引起的偏瘫、记忆障碍、儿童智力发育迟缓等多种疾病均有不同程度的疗效，具有很好的应用前景。目前市场上已出现多种添加或号称富含GABA的保健食品和药品。因此，发展一种简便快捷的测量方法准确测定GABA含量具有重要意义。

目前GABA的定量分析常用(超)高效液相色谱法、电泳法和纸层析法、氨基酸自动分析仪法等。因GABA自身在可见区和近紫外区都无明显吸收，测定时多是基于GABA与其他试剂反应生成的衍生物的光吸收进行测定。常用衍生化试剂主要有苯二醛-2-巯基乙醇、丹磺酰氯以及邻苯二甲醛和水合茚三酮等。其中水合茚三酮因反应产物颜色明显，在可见区即可测定，对仪器的要求低，应用较广。虽已有关于水合茚三酮显色法测定氨基酸的报道，但不同文献报道的测定条件不尽相同，且水合茚三酮与结构不同的氨基酸的显色反应也存在差异。因此本文针对GABA，研究了各种因素对其与水合茚三酮显色反应的影响，确定了最佳测定条件，并考察了该方法的重现性、准确度、选择性等分析性能，并结合薄层色谱实现了食品添加剂中GABA的测定。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

PH-10/100 酸度计(上海越平科学仪器);PE Lambda 35紫外可见分光光度计(Perkin-Elmer Co.，Wellesley， MA， USA);HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器);FA 1204C型电子分析天平(上海越平科学仪器)。

GABA(批号：H1829037)，购自阿拉丁生化科技股份有限公司；水合茚三酮(批号：20200507)、乙醇(批号：20200612)、磷酸(批号：20190715)、可溶性淀粉、聚乙二醇、二氧化铈、氯化亚锡、Fe2(SO4)3·xH2O、FeCl2·4H2O、Na2SO4，以上试剂均为分析纯，购自国药集团。玉米淀粉发酵提取的含GABA的食品添加剂，购自浙江益万生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 最佳测量波长的选择

在10 mL比色管中加入2 mL 64 g·L^-1 GABA(或水)、2 mL 0.3 mol·L^-1 pH=5.0的磷酸缓冲溶液和1 mL 3.2 g·L^-1的水合茚三酮溶液(用水或乙醇溶解)，混合均匀后，沸水浴20 min， 冷却至室温后，用水定容至5 mL，用紫外可见分光光度计分别测其吸收光谱，比较水溶和醇溶的区别，并确定适宜的测定波长。

1.2.2 显色条件的影响和选择

本文采用单变量比较法分别研究酸度、显色剂用量、显色温度和加热时间对显色测定的影响。具体来说，在10 mL比色管中依次加入1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液、1 mL不同pH的磷酸缓冲溶液(0.3 mol·L^-1)和2 mL不同浓度的水合茚三酮乙醇溶液，用水定容至5 mL，混匀并水浴加热一定时间后，冷却至室温，定容至5 mL，混匀后测其吸收光谱，并比较不同条件下显色后溶液在选定波长的吸光度。

1.2.3 茚三酮显色法测定GABA的性能评价

探究酸度、显色剂用量、温度和加热时间等因素对显色的影响后，在最佳显色条件下分别对水合茚三酮显色测定GABA的工作曲线、重现性和抗干扰能力等进行了考察。

干扰物的选择主要是样品中可能存在的共存组分和根据显色原理可能会干扰的一些物质。将40 mg·L^-1的GABA溶液及相同浓度GABA但加有不同干扰物的混合液(1.5 g·L^-1淀粉、15 mg·L^-1聚乙二醇、45 mg·L^-1 Fe3+、30 mg·L^-1 Fe2+、15 mg·L^-1氯化亚锡和15 mg·L^-1二氧化铈)分别在最佳条件下显色测定，并比较加入干扰物对溶液吸光度的影响，考察水合茚三酮显色法测定GABA的抗干扰能力。

1.2.4 薄层色谱分离与实际样品检测

为避免实际样品中可能存在的其他氨基酸或蛋白质对测定结果的影响，在进行光度测定前进行了薄层色谱分离。薄层色谱条件为：高效硅胶薄层板(50 mm×200 mm， 100℃下活化1 h)，点样3 μL，展开剂为正丁醇、冰乙酸、水混合液(4∶2.2∶1，V/V)，显色方法：以2%的茚三酮乙醇溶液为显色剂，喷洒后在烘箱中100℃加热显色至斑点清晰。

将薄层色谱分离后的GABA斑点取下溶解，在选定条件下，利用水合茚三酮对市售食品添加剂中GABA进行测定，并通过三个不同浓度的加标回收及与其他氨基酸的分离实验评价该方法的准确度。

2 结果与讨论

2.1 水合茚三酮溶剂的选择与最佳测量波长的确定

文献报道中，常以水或乙醇为溶剂溶解水合茚三酮作为显色剂来检测游离氨基酸，故本文首先对比用水和乙醇分别溶解水合茚三酮对GABA测定的区别。在相同浓度下以对应试剂空白为参比得到的结果如图1所示。水溶的水合茚三酮与GABA沸水浴后和水溶的水合茚三酮溶液自身沸水浴后在可见区内均无明显吸收峰，而乙醇溶解的水合茚三酮与GABA沸水浴后在420 nm和567 nm有明显吸收峰，故用乙醇溶解水合茚三酮较好。此外，因在420 nm处的吸收峰与水合茚三酮乙醇溶液自身沸水浴后在357 nm处的吸收峰有重合，为避免干扰，选择567 nm作为测量波长最佳。

2.2 显色条件的影响

显色条件对于GABA定量转化成有色吸光物质至关重要。本文采用单变量比较法分别研究了酸度、显色剂用量、显色温度和加热显色时间对显色测定的影响，具体分别讨论如下。

2.2.1 酸度的影响

文献报道的茚三酮显色法测定氨基酸的酸度条件差别较大，为探究茚三酮显色测定GABA的最佳酸度，将1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液和2 mL 1.6 g·L^-1水合茚三酮乙醇溶液，分别在不同pH下沸水浴20 min， 冷却后，定容混匀并测567 nm处的吸光度，结果如图 2 a所示。在pH=3.0和4.0时，水合茚三酮乙醇溶液与GABA沸水浴后测得吸光度几乎为零，故此酸度不适宜显色。当pH大于4.0时，水合茚三酮与GABA的显色反应正常进行，吸光度随pH的升高逐渐升高，并在pH=7.0时达到峰值，随后呈明显下降趋势。这说明水合茚三酮与GABA的显色反应需在适宜酸度范围内进行，pH=7.0为最佳显色酸度。

2.2.2 显色剂用量的影响

为探究显色剂用量的影响，在确定最佳显色酸度的基础上(pH=7)将1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液分别和2 mL不同浓度的水合茚三酮乙醇溶液沸水浴20 min， 冷却至室温后定容，测567 nm处的吸光度。结果如图 2 b 所示。在水合茚三酮浓度为0.4～1.6 g·L^-1时，显色后吸光度随水合茚三酮浓度的增加呈明显增加趋势。当水合茚三酮浓度在1.6～3.2 g·L^-1时，吸光度变化较小。本文后续均采用1.8 g·L^-1的水合茚三酮乙醇溶液进行显色。

2.2.3 显色温度的影响

加热可加速反应的进行，但温度太高也会影响试剂的稳定性。将1 mL 64 mg·L^-1的 GABA水溶液、1 mL pH=7磷酸缓冲溶液和2 mL 1.8 g·L^-1的水合茚三酮乙醇溶液混匀后定容至5 mL，然后分别在不同温度下水浴加热30 min， 冷却后再用水定容至5 mL摇匀，测567 nm处的吸光度。结果(图2 c)表明：在40～70℃水浴加热30 min， 吸光度几乎为0，说明水合茚三酮与GABA基本没发生显色反应，无法测定；当加热温度为85℃时，吸光度增大，水合茚三酮与GABA部分显色，但反应不完全；当水浴温度升高至100℃时，吸光度急剧增大，水合茚三酮与GABA的显色反应程度显著增高；温度继续增高会影响茚三酮的稳定性，故确定100℃为最佳显色温度。

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