发酵食品是一种传统的食物保存方法，据《美国心脏病学院杂志》报道，发酵食品中所含的益生菌有益于心脏健康。有学者指出：发酵食品中的益生菌有利于改变肠道中的微环境，通过调节人的肠道菌群来缓解社会焦虑症。发酵冬瓜（smellywaxgourd，SWG），又称“臭冬瓜”，是浙东地区传统的发酵食品，因其独特的风味而被称为开胃菜。冬瓜在发酵过程中产生大量的微生物，其中优势菌是乳酸菌，它通过分解碳水化合物产生乙醇、脂肪酸和过氧化物降低了肠道的pH，抑制了细菌病原菌的生长。发酵冬瓜还产生可具有调节健康潜力的物质，如维生素B、叶酸等，也合成具有神经递质和免疫调节功能的氨基酸及其衍生物。冬瓜在发酵中通常产生大量的微生物，这些微生物中有相当大一部分通过人类消化道存活。

肠道菌群是近年来人们最为关注的焦点之一，一个人的身体健康状况不仅取决于自身的遗传因素，而且还与人体肠道微生物组成成分密切相关。特定的饮食成分对肠道菌群的组成成分以及小分子代谢产物的形成具有深远的影响，这些微生物可以直接或间接地通过肠上皮影响机体的代谢机制，当饮食发生变化时，肠道菌群结构也会发生一系列的变化。饮食影响肠道菌群，进而影响宿主的生理功能、免疫应答或生长性能。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一种广泛分布于环境中的革兰氏阳性球菌，在人和家畜的体表尤其在和外界相通的腔道中检出率相当高，也是冷藏食品和盐渍食品重要的致病性微生物，通过分泌丰富的毒力分子阻断人体免疫反应，使得细菌逃避来自宿主免疫系统的攻击，造成人类广泛的疾病，如脓疱病、菌血症和肺炎等。尽管目前已有相关研究表明，可通过生物学方法制备特异性受体靶向作用于金黄色葡萄球菌毒素，从而达到保护机体的目的，但仍然存在诸多问题。例如，研究人员发现，一种特异的小分子球状蛋白Centyrins（～10kDa），能够靶向金黄色葡萄球菌分泌的杀白细胞素（Leukocidins），从而使宿主免受毒素侵害，但由于金葡菌具有耐药性强、易变异等特点，使得这种单靶点治疗方法失败率较高。因此，本文尝试采用发酵冬瓜探究其对金黄色葡萄球菌感染小鼠的缓解作用，实验用发酵冬瓜和金黄色葡萄球菌对小鼠进行灌胃处理，利用高通量测序技术研究小鼠肠道菌群结构的变化情况，旨在为通过饮食干预治疗金黄色葡萄球菌感染性肠道疾病奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4～5周龄ICR小鼠40只（20±2g），雌雄各半浙江省实验动物中心[动物编号：1710300006，许可号：SCXK（浙）2014-0001]；冬瓜盐胚、自然发酵的卤水宁波三臭居公司，按固液1:1（w:v）比例混合，制成匀浆后保存在-80℃冰箱；金黄色葡萄球菌宁波大学海洋学院实验室分离并保存；E.Z.N.A.StoolDNAKit试剂盒广州飞扬生物工程有限公司。NanohomogenizemachineAH100D型ATS高压均质机ATSEngineering公司；7890A/M7-80EI型气相色谱-质谱联用仪美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

将选取成熟冬瓜，去皮除瓢，切成6～10cm大小的块状煮至七八分熟，盐胚浸入臭卤中，按1:1（w:v）比例混合，常温密封发酵后，放入高压均质机中制成匀浆备用。金黄色葡萄球菌，在蛋白胨、牛肉膏培养基中37℃摇床过夜培养24h，稀释成106CFU/mL悬液备用。

1.2.2 动物实验

将实验小鼠按性别随机分成4组，共8组，每组5只，标记后称重记录初始体重。对照组（CT）每日灌胃生理盐水（20g/kg/day），冬瓜组（SW）每日灌胃发酵冬瓜混合菌液（20g/kg/day），其中发酵冬瓜的灌胃量前期做了预实验，发现对小鼠使用这个剂量能与感染金黄色葡萄球菌抗衡。金葡组（SA）每日灌胃金黄葡萄球菌液100μL，金葡+冬瓜处理组（SA+SW）每日灌胃金黄葡萄球菌液（10g/kg/day）和发酵冬瓜（10g/kg/day），连续给药4周。每周测量体重。整个实验过程，小鼠自由摄食和饮水，控制室内温度（23±1℃）和湿度（55%±10%），循环12h光照/黑暗（灯光）。小鼠灌胃4周后收集粪便于-80℃冰箱备用。

1.2.3 高通量测序

1.2.3.1 模板的制备

将粪便样品收集后立即置于液氮中冷冻，随后储存至-80℃冰箱中备用。利用QIAampDNAStoolMini提取试剂盒抽提粪便DNA，使用ThermoNanoDrop2000UV-Vis测定DNA浓度和纯度。

1.2.3.2 16SrDNA测序

基因组样品用DNAQubit2.0进行精确定量后，对16SrRNA可变区（V3+V4）进行PCR扩增，预变性98℃30s，35个循环，每个循环包括：变性98℃10s，退火54℃30s，延伸72℃45s，最后延伸10min进行扩增。扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并切胶回收，精确定量后上机测序。样品通过Illuminamiseq测序仪进行2×300bp的双端测序，并利用生物信息学进行分析。

1.2.4 小鼠粪便短链脂肪酸含量测定

粪便干燥后称取30±1mg，加入0.8mL的水，0.2mL50%的硫酸，1mL乙醚提取脂肪酸，并用气-质联用仪测定。GC检测条件：DB-WAX聚乙二醇毛细柱（60m×0.25mm×0.25μm），进样口温度设为250℃，检测温度为250℃。升温程序。MS检测条件：离子源温度为230℃，监测方式为全扫描，EI电离，扫描的质量范围为45～450u，扫描的时间为46min，溶剂延迟时间为7min。

1.3 数据处理

利用SPSS20.0软件，采用单因素方差分析（onewayANOVA）比较各组间的统计学差异。符合正态分布的数据采用ANOVA和Tukey'sposthoctest进行分析，不符合方差分析特征的数据采用MannWhitneytest。*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异极显著，P＜0.01；***表示极其显著，P＜0.001。

2 结果与分析

2.1 肠道菌群的变化

2.1.1 菌群多样性

如图1和图2所示，发酵冬瓜和金黄色葡萄球菌显著（P＜0.05或P＜0.01）提高了雄性小鼠肠道菌群的多样性和丰富度。而雌性小鼠只有喂食发酵冬瓜后肠道菌群的多样性和丰度显著提高(P＜0.01）。通过加权主坐标分析（UniFracPCoA）发现喂食发酵冬瓜、金黄色葡萄球菌、金葡菌和发酵冬瓜的小鼠肠道菌群结构与对照组小鼠的肠道菌群结构存在明显差异。

相关链接：金黄色葡萄球菌，聚乙二醇，琼脂糖，叶酸

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