如图2所示，当牡蛎发酵培养基的接种量为4％时，氨基态氮的含量最高，但是蛋白质含量未达到最低。接种量在继续增加的同时，氨基态氮和蛋白质二者的含量走向都呈现降低趋势。这可能是因为在接种量过低时，纳豆芽孢杆菌繁殖较慢，产酶过少；而当菌种接种量过大时，菌种繁殖过快，密度过大，导致氧气接触不足，导致代谢产物较少。而且牡蛎肉作为纳豆芽孢杆菌繁殖代谢的主要营养基质，其中丰富的蛋白质被纳豆芽孢杆菌自身分泌的蛋白酶分解成寡肽和氨基酸，使得发酵液中含有丰富的氨基态氮。而当发酵液中小分子肽和氨基酸含量与蛋白质含量相差较多时，纳豆芽孢杆菌会优先消耗小分子物质，从而导致当接种量过多时蛋白质与氨基态氮的含量均随之逐渐降低。表明在接种量2％～6％之间时，氨基态氮处于含量最高期。

如图3所示，当接种量固定为4％时，发酵时间在12h～48h范围内，氨基态氮的含量在不断增加，在发酵时间为48～60h时稍有下降，可能是由于纳豆芽孢杆菌消耗蛋白质的同时开始利用小分子的氨基酸导致，也有可能是因为蛋白酶活力在发酵48h时达到最大，发酵时间是影响纳豆芽孢杆菌产酶的重要因素，在产酶总量达到最大值之后继续发酵可能会导致蛋白酶酶活下降。在12h～60h期间，蛋白质的含量在不断下降。在36h～48h期间氨基态氮含量与蛋白质含量的变化趋缓，此时的纳豆芽孢杆菌在水解蛋白质和消耗氨基酸的过程中处于平衡期。纳豆芽孢杆菌产酶最高值后应立即停止发酵，否则酶活力会出现回落现象。因此，在固定条件接种量为4％和发酵时间48h下进行后续试验。

2、正交试验优化发酵条件

在固定料液比l:4(g／mL)，发酵温度37℃和葡萄糖添加量2％的基础上，对单因素试验的数据结果进行分析并选取合适的发酵条件范围，以发酵pH、接种量、发酵时间为主要因素，并以测定的氨基态氮含量作为参考，进行三因素三水平L₉(3³)正交优化试验，具体试验方案和结果见表1。

由表1分析可知，以氨基态氮含量为指标，各因素的影响依次为A＞B＞C，即接种量对氨基态氮含量的影响最大，其次是发酵时间，发酵pH对氨基态氮含量的影响最小。由正交试验结果分析确定最佳优化工艺条件：A₃B₃C₂，即发酵pH为7，接种量为6％，发酵时间为48h。

由表2方差分析可知，此次试验的三个因素中，接种量对氨基态氮含量具有显著性影响(P＜0．05)，发酵时间和发酵pH对试验结果无显著性影响(P＞0.05)。

3、验证试验

为验证正交试验所得结果的可靠性，在上述最佳发酵工艺条件下进行三次平行试验并测定发酵液中氨基态氮含量。经测定，所得发酵液中氨基态氮含量为0．785mg／mL，与正交试验结果接近，证实试验结果可靠。

三、结论

本试验以低价购买市场淘汰的牡蛎废料作为发酵主要原料，用纳豆芽孢杆菌对其进行发酵，可以提高牡蛎的利用价值。固定料液比1:4，发酵温度37℃和葡萄糖添加量2％，通过单因素试验选取适宜发酵条件范围：发酵pH为6～8，接种量为2％～6％，发酵时间为24h～48h。在此基础上，通过正交设计优化试验确定纳豆芽孢杆菌发酵牡蛎的最佳发酵条件为：发酵pH7，接种量6％，发酵时间48h，此时发酵液中氨基态氮的含量达到0．791mg／mL。

本试验的发酵结果表明，纳豆芽孢杆菌可以用于牡蛎的发酵，为水产动物的应用提供了理论基础，为蛋白高值化提供了依据，同时为水产品的开发提供新的方向，充分利用市场淘汰的牡蛎边角料。而且，发酵水解液氨基态氮含量丰富，水解液经过浓缩提取也可以制备氨基酸口服液、氨基酸含片、氨基酸护肤品、氨基酸添加剂等，本研究为氨基酸产品的制备提供了依据。

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