海湾扇贝(Argopectenirradians)是一种重要的经济类海洋贝类。海湾扇贝柱富含多种营养成分，蛋白质、脂肪、糖类质量分数分别占14.03％，1.20％和3.07％，其中的总糖质量分数显著高于岩扇贝(1.9％)、虾夷扇贝(1.79％)及栉孔扇贝(0.45％，极具开发价值。据报道，扇贝多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化和抗凝血等活性，已经成为重要的功能食品资源。

由于扇贝不易贮藏，干制成为扇贝储藏的主要手段。由于多糖与蛋白质相连，而海洋贝类普遍具有高蛋白质的特性，热加工干制过程会加速两者的结合，提取的多糖成分通常会含有蛋白质杂质。为减轻蛋白质对多糖结构和生物活性研究的干扰，脱蛋白质具有重要的意义。目前较普遍的蛋白质脱除方法如：TCA法、Seveage法、酶法等，其中，Seveage法不适合食品加工行业。现阶段对于扇贝多糖脱蛋白质的研究多集中于多糖得率和蛋白脱除率上，如李雪梅等，乙醇沉淀法结合TCA法脱除海湾扇贝多糖的蛋白质，脱除率达90％以上；刘禹等的研究表明，一种新兴的D-葡萄糖酸-6-内酯(GDL)蛋白质脱除法，对虾夷扇贝多糖的蛋白质脱除率可达99％，效果优于TCA法。

蛋白质脱除方法在不同程度上都会影响到多糖的含量、得率或者活性，目前，关于蛋白质脱除方式对多糖结构、活性的影响鲜有报道。作者对干贝多糖进行不同方式的脱蛋白质处理，并比较了蛋白质脱除方式对干贝多糖结构和抗氧化活性的影响，以期找山干贝多糖的最佳脱蛋白质方法，为研究干燥过程对干贝多糖的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验原料为海湾鲜扇贝，由大连玉洋集团有限公司提供，鲜贝柱于50℃下烘干，自制为干贝柱，粉碎备用。术瓜蛋白酶(1×10⁵u/g)、碱性蛋白酶(2×10⁵u/g)：上海瑞永生物科技有限公司产品：氢氧化钠(分析纯)：沈阳市联邦试剂厂产品；三氯乙酸(TCA)：天津市科密欧化学试剂有限公司产品；浓硫酸(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司产品；D-葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)：阿拉丁试剂(上海)有限公司产品；过氧化氢(分析纯)、水杨酸(分析纯)：北京化学试剂有限公司生产产品；FeSO₄·7H₂0(分析纯)：天津市大茂化学试剂厂产品；苯酚、无水乙醇(分析纯)：新光化工试剂厂产品；二苯基苦味肼基自由基(DPPH)：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司产品。

1.2 仪器与设备

PAL-1便携式折光仪：日本ATAGO公司产品：XH-C漩涡混匀仪：常州越新仪器制造有限公司产品：SYNERGYHI酶标仪：美国伯腾仪器有限公司产品：UDKl52全自动凯氏定氮仪：意大利VELP公司产品：DY-200-BZ空气浴振荡摇床：厦门德仪设备有限公司产品：高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司产品：L-8900型氨基酸自动分析仪：日本HITACHI公司产品：G121M湘仪离心机：上海医疗器械有限公司手术器械厂产品：FD-1型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司产品；Lambda25紫外-可见分光光度计：美国PerkinElmer公司产品：Sigma300扫描电子显微镜：卡尔蔡司(上海)管理有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 干贝粗多糖的提取

精确称取适量干贝柱粉，以液料体积质量比为40mL:1g加入去离子水，在80℃下热水浸提4h后超声9min。过滤滤渣，调整浸提液固形物质量分数至10％，添加质量分数2％的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解时问3h、温度57.8℃、pH7.1。离心取上清液，加入体积分数95％乙醇至乙醇最终体积分数为75％，4℃静置12h后，离心取沉淀，挥醇后冻干，得干贝粗多糖(DAMP)。将DAMP配制成质量浓度为50mg/mL的粗多糖溶液备用。

1.3.2 碱酶法蛋白质脱除

参照韩莹等的方法并略做改进。将粗多糖溶液pH值调至10，加入碱性蛋白酶使酶质量分数为2％，于50℃酶解3h，沸水浴10min灭酶，4000r/min离心10min，收集上清液，醇沉后冷冻干燥。

1.3.3 稀碱法蛋白质脱除

参照陈利华等的方法并略做改进。60℃下用0.1moL的NaOH溶液提取3h，4000r/min离心10min，收集上清液，醇沉后冷冻干燥。

1.3.4 FCA法蛋白质脱除

参照李雪梅等的方法并略做改进。将质量分数2％的TCA溶液与一定体积的粗多糖溶液等体积混合，震荡反应3h，4000r/min离心10min，收集上清液，醇沉后冷冻干燥。

1.3.5 GDL法蛋白质脱除

参照刘踽等的方法并略做改进。向粗多糖溶液中加质量分数2％的GDL溶液，使GDL的终质量分数达到0.3％～0.5％。置于45℃的恒温水浴锅中反应3h，4000r/min离心10min，收集上清液，醇沉后冷冻干燥。

1.3.6 蛋白质脱除率及多糖损失率的计算

采用苯酚-硫酸法测定多糖，采用凯氏定氮法旧测定蛋白质质量分数，测定3组平行取平均值。蛋白质脱除率及多糖损失率的计算公式如下：

式中：X₀为脱蛋白质前样品中蛋白质量分数；X₁为脱蛋白质后样品中蛋白质量分数。

式中：m₀为脱蛋白质前样品提取物质量；m₁为脱蛋白质后样品提取物质量。

1.3.7 单糖组成分析

采用PMP柱前衍生高效液相色谱法测定脱蛋白质纯化后多糖的单糖组成，具体操作参考文献。

1.3.8 氨基酸组成分析

使用氨基酸自动分析仪测定氨基酸种类与含量，氨基酸质量分数以mg/g表示。具体操作参考文献。

1.3.9 刚果红试验

参照陈杨扬等的方法并略做改进。称取多糖样品各1mg，加入1mL蒸馏水和80μmol/L刚果红溶液2mL，充分混匀后加入NaOH，使各组NaOH终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L，并用紫外全波段扫描，记录不同NaOH浓度下的最大吸收波长。

1.3.10 扫描电镜分析

参照Wang等的方法并略做改进。取适量经蛋白脱除的多糖样品，镀上导电金粉后将其放置于扫描电镜下观察。工作条件：加速电压15kV，观测倍数分别选用200、1000、10000倍。

1.3.11 DPPH自由基清除能力的测定

参照Odeleye等的方法并略做改进。将待测样品配制为30mg/mL的样液，用无水甲醇依次稀释成2、4、6、8、10mg/mL梯度。将2mL样液与2mL0.16mmol/LDPPH-甲醇溶液(6.3lmg/dL)混合均匀。以VC作阳性对照，室温下避光静置30min后于517nm下用酶标仪测定吸光值。每个浓度梯度进行3组平行试验。DPPH清除率计算方式为：

式中：A₀为无水甲醇代替样品的测得吸光度值；A₁为样品溶液的测得吸光度值；A₂为无水甲醇代替DPPH测得的吸光度值。

1.3.12 羟基自由基清除能力的测定

参照Liu等的方法并略做改进。将待测样品配制为30mg/mL的原液，依次稀释成2、4、6、8、10mg/mL的溶液。将1mL样液与1mL9mmol/LFeS04溶液、1mL9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和1mL8.8mmol/L的H₂0₂溶液混合均匀，37℃水浴30min，以VC作阳性对照于510nm下测吸光值，清除率按下式计算：

式中：A₃为去离子水代替样品的测得吸光度值；A₄为样品溶液的测得吸光度值；A₅为去离子水代替H₂0₂溶液测得的吸光度值。

1.3.13 数据处理

实验结果以(平均值±标准偏差)表示，实验数据采用SPSSStatistics17.0软件进行单因素ANOVA分析，显著性水平设定为0.05。

相关链接：水杨酸，过氧化氢，木瓜蛋白酶，二苯基苦味肼基自由基(DPPH)

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