1.3.6 酶的定位及活性测定

1）粗酶液的制备

将屎肠球菌R2以3%接种量接种到黄浆水培养基中，于37℃下静置培养，分别于12，24，36h取发酵液。发酵液于4℃下5000r/min离心10min，得菌液上清及沉淀；菌体沉淀用生理盐水洗涤2次后，悬浮于2mL、pH=5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，于冰浴条件下进行超声破碎，超声功率130W，破碎时间15min，间隔时间2s。破碎后于4℃、12000r/min下离心10min，得菌体碎片和破碎上清；菌体碎片用5mL、pH=5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤2次后溶于1mLpH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液中用作酶活测定，菌液上清、破碎上清直接进行酶活测定。

2）绘制标准曲线

准确称取0.1391g对硝基苯酚，精确到0.001g，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100mL，4℃下保存备用。依次移取对硝基苯酚标准贮备液1，2，3，4，5，7，9mL，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100mL，配成浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7，0.9mmol/L的对硝基苯酚标准工作液。

吸取1mL对硝基酚标准溶液于试管中，加入1mLpH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；对照的空白试管中加入2mLpH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；在所有的试管中加入8mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡，在400nm处测定吸光值。以对硝基苯酚含量为X轴、吸光值为Y轴，绘制标准曲线。标准曲线方程为Y=1.642X+0.006，R²=0.999。

3）酶活测定

将粗酶液、10mmol/L对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液和10mmol/L对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液分别于37℃水浴中预热10min。然后吸取0.4mL粗酶液于干净的试管中，分别加入0.4mL对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液或10mmol/L对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液，破碎上清和破碎沉淀酶活测定以缓冲液代替粗酶液作为空白对照，菌液上清酶活测定以加热使酶失活的上清液作为空白对照，于37℃中水浴10min后，加入3.2mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡混匀，终止酶反应，待冷却至室温后，将反应液于400nm处测定吸光值。按照标准曲线回归方程计算样品中菌液上清、破碎上清和破碎沉淀中的α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活力。

酶活力单位定义：在37℃，pH5.0条件下，1min催化生成1nmol对硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活单位（U）。

1.3.7 对DPPH·清除能力的测定

参考刘力的方法略有修改，取2.0mL0.05g/LDPPH无水乙醇溶液，加入2.0mL发酵液，摇匀，置于25℃水浴中避光反应30min后，于8000r/min下离心10min，期间注意避光。在517nm处测定吸光度值。蒸馏水作为对照，Ｔrolox作为标准物质，绘制标准曲线。标准曲线方程Y=-0.0285X+0.8299，R²=0.9907，结果以μgＴrolox/mL表示。

1.4 数据处理

结果以平均值±标准差表示。使用SPSS18.0软件对结果进行统计分析（One-wayANOＶA），利用Duncan’smultiplerangetest方法进行显著性分析，选取P＜0.05为显著水平。采用OriginPro8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中酸度的变化

豆腐黄浆水中含有小分子糖类、蛋白质及一些生物活性物质，适于微生物的生长，pH值可以反映屎肠球菌R2发酵黄浆水后形成的游离H+和有机酸的变化情况。图1为屎肠球菌R2发酵黄浆水过程中OD值和pH的变化规律。从图1中可以看出，屎肠球菌R2能够利用豆腐黄浆水中的小分子糖类生长，降低黄浆水的pH值。随着发酵时间的延长，菌体生长量逐渐增加，pH值逐渐下降，其中12～24h之间菌体生长最快，pH下降最明显。

2.2 发酵处理对豆腐黄浆水中低聚糖含量的影响

2为屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水过程中低聚糖含量的变化规律。新鲜豆腐黄浆水中5种糖的含量为19418.22mg/L，其中水苏糖和蔗糖含量较高，水苏糖含量占5种糖含量的58%，蔗糖含量占5种糖含量的30%，棉籽糖、葡萄糖和果糖的含量相对较低。在屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水的过程中，低聚糖含量均有不同程度的下降。发酵12h后，葡萄糖的含量迅速下降，利用率达到43%，其次为棉籽糖和果糖，利用率均为17%，水苏糖和蔗糖的利用率较低，分别为4%和3%；发酵24h后葡萄糖基本利用完毕，无法检出。此时，果糖的利用率达到68%，棉籽糖的利用率达到22%，水苏糖和蔗糖的利用率均为12%。表明屎肠球菌R2在发酵豆腐黄浆水时优先利用葡萄糖，其次为果糖和棉籽糖；发酵36h后，果糖的含量几乎没有发生变化（P＜0.05），蔗糖的利用率达到31%，棉籽糖和水苏糖的利用率分别为38%和24%。因此，经过屎肠球菌R2的发酵作用，可以有效地缓解棉籽糖和水苏糖引起的胃胀气。

2.3 屎肠球菌R2α-半乳糖苷酶的定位及活性分析

棉籽糖和水苏糖的代谢需要α-半乳糖苷酶，研究表明，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）、干酪乳杆菌（Lact.casei）、植物乳杆菌（Lactplantarum）、发酵乳杆菌（Lact.fermentum）、短乳杆菌（Lact.sbrevis）、布氏乳杆菌（Lact.buchneri）、肠膜明串株菌（Leuconostocmesenteroides）和罗伊氏乳杆菌（Lact.reuteri）等在发酵的过程中可以分泌α-半乳糖酶，将α-半乳糖苷类寡糖水解为可消化的糖类。屎肠球菌R2不同部位的α-半乳糖苷酶酶活见图3。如图3所示，菌液上清酶活几乎为零，说明α-半乳糖苷酶没有被分泌到细胞外，屎肠球菌R2的α-半乳糖苷酶不是胞外酶；细胞破碎并离心后，细胞破碎上清和破碎沉淀均具有酶活，说明屎肠球菌R2的α-半乳糖苷酶属于胞内酶；细胞破碎沉淀酶活显著高于破碎上清酶活，说明该酶以可溶性蛋白和不可溶性蛋白两种形式存在，且主要以不可溶性蛋白形式为主。这一结果与Ames等的研究一致，其研究表明大多数α-半乳糖苷酶位于G+阳性菌细胞质中。Mital等研究证明乳酸菌所产生的α-半乳糖苷酶类的活性范围在pH4.5～8.0，而屎肠球菌R2发酵36h后pH下降到3.58（图1），严重偏离了该酶的最适pH，这导致了豆腐黄浆水中棉籽糖和水苏糖被部分分解（图2），而不是被全部降解，这一结果与付亭亭等的研究一致。

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