随着人们对自由基生命研究的不断关注，氧化应激损伤和抗氧化保护作用的研究成为热点。因人体中抗氧化的物质有限当氧化剂与人体内抗氧化剂失去平衡时，人体会处于氧化应激状态。当体内的氧化剂浓度超过细胞防御能力时，氧化损伤可引起如癌症，多发性硬化症和心血管疾病等疾病。目前最常见的是化学抗氧化剂，但因其有一定的毒副作用所以使用受到限制。近年来研究发现，由蛋白酶水解制得的生物活性肽具有一定的抗氧化能力，水解出的抗氧化肽与大分子蛋白质相比，显具有更高的生物活性，抗氧化肽在体内积累具有清除自由基和抑制脂质过氧化的功能，能够维持机体内自由基的平衡，从而提高机体抗衰老和抗疾病的能力。抗氧化肽因其具有安全、高效、易吸收等特点，在保健、医疗等领域受到了管饭的重视。

绿豆又名青小豆，属于医食两用作物，是我国主要的粮食作物之一，在全国多地区种植，年均产量在6l万吨且富含高质量的植物蛋白，是优质的食品加工原料。食用绿豆益处繁多，如可以降低血脂、提高机体免疫力、预防衰老以及具有抗氧化等作用。绿豆多肽中的抗氧化活性肽相对分子质量小，具有良好的水溶性、低黏度、稳定性强，是天然的抗氧化剂，能够起到清除体内自由基、抑制生物大分子物质过氧化的作用，具有延缓衰老、预防疾病等优点，有很高的利用价值。但就目前而言，绿豆抗氧化多肽的制备工艺研究较少，不能满足现阶段的需求，生产成本较高，制备工艺不太成熟，对于绿豆多肽提取的研究有着重要意义。

一、材料与方法

1、材料及试剂

绿豆蛋白：实验室自制；盐酸：中国医药上海化学试剂公司；碱性蛋白酶(6000U/g)：Sigma试剂公司；氢氧化钠、DPPH、无水乙醇：以上均为分析纯，均购自天津市科密欧试剂有限公司。

2、主要仪器设备

紫外可见分光光度仪：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；精密pH计：梅特勒托利多仪器(上海)有限公司；恒温干燥箱：湘仪离心机仪器有限公司；电子天平(RSJ200—4)：湘仪离心机仪器有限公司；离心机(TDZ5一WS)：湘仪离心机仪器有限公司。

3、实验方法

（1）绿豆抗氧化肽的制备

将绿豆蛋白配置成一定浓度的溶液，水浴加热至100℃进行15min均质处理。待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段时间后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。

（2）DPPH自由基清除能力的测定

参照于慧等人的方法进行DPPH自由基清除率的测定。将2mL一定浓度的绿豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液进行混合，避光于25℃条件下反应30min，取出后于517nm波长下进行吸光值的测定，此时吸光度值记录为A_i；将上述过程中的2mLDPPH溶液用无水乙醇取代，然后与2mL绿豆多肽溶液进行反应，此条件下测定吸光值记录为A_j，将2mL无水乙醇与2mLDPPH溶液反应的条件作为空白组，此时记录吸光值为Ao。
DPPH清除率计算公式如下：

A_i：样品组吸光度值；

A_j：对照组吸光度值；

A₀：空白组吸光度值。

（3）单因素实验

本实验在于研究酶法对绿豆蛋白水解的抗氧化肽的工艺优化，故以DPPH为指标，选择酶解时间、酶解温度、酶添加量以及pH为因素进行单因素实验。

①酶解温度对绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、pH为9、酶解时间3h作为固定条件，测定当酶解温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五个条件下时的DPPH清除率。

②酶浓度对绿豆多肽抗氧化性的影响

将pH为9、酶解温度50℃、酶解时间3h作为固定条件，测定当酶浓度分别为2％、4％、6％、8％、10％五个条件下时的DPPH清除率。

③pH对绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、酶解温度50℃、酶解时间3h作为固定条件，测定当pH分别为7、8、9、10、11五个条件下时的DPPH清除率。

④酶解时间对绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、pH为9、酶解温度50℃作为固定条件，测定当酶解时间分别为0.5h、lh、2h、3h、4h五个条件下时的DPPH清除率。

（4）响应面优化设计

通过单因素实验的结果，可以筛选出各因素的三个水平。所以在此基础之上，应用统计分析软件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，进行回应面优化设计。因素和水平取值如表1所示。

二、结果与讨论

1、单因素实验结果

（1）绿豆多肽抗氧化性与酶解温度的关系

将绿豆蛋白配置成一定浓度的溶液，水浴加热至100℃进行15min均质处理。待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段时间后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。结果如图1所示。

由图1可知，当酶解温度低于50℃，DPPH清除率与温度成正比，当温度超过50℃时，DPPH清除率开始下降。这是因为蛋白酶对稳定的要求较高，温度过低会影响酶解的反应速度，使酶解反应不彻底，从而影响抗氧化肽的抗氧化效果。而温度过高则会影响蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，无法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，从而使DPPH清除率降低。

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