2.4 发酵处理对豆腐黄浆水中有机酸含量的影响

表4显示了屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水过程中乳酸、醋酸、酒石酸等9种有机酸的变化。结果表明，在新鲜豆腐黄浆水中丁二酸含量最高，柠檬酸含量次之，接下来为醋酸、酒石酸、苹果酸和乳酸，马来酸和富马酸含量很低，草酸含量最低，未检出。

2.5 发酵处理对豆腐黄浆水中大豆异黄酮组成和含量的影响

大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，具有抗肿瘤、预防心血管疾病、骨质疏松症、改善妇女更年期综合征等多种功效。大豆异黄酮共有12种异构体，以游离型黄酮苷元（Aglycones）和结合型糖苷（Glycosides）2种形式存在。苷元型大豆异黄酮主要包括染料木素（Genistein）、黄豆黄素（Glycitein）和大豆苷元（Daidzein）；糖苷型大豆异黄酮主要包括染料木苷（Genistin）、大豆黄素苷（Glycitin）、大豆苷（Daidzin）以及它们各自的乙酰基葡萄糖苷和丙二酰葡萄糖苷衍生物。

天然存在的大豆异黄酮主要以结合型β-葡萄糖苷的形式存在，这种形式的大豆异黄酮较难被人体吸收；游离苷元型大豆异黄酮不仅具有更高的生物活性，而且更容易被肠道吸收。

研究了屎肠球菌R2的发酵作用对豆腐黄浆水中染料木苷、大豆黄素苷、大豆苷、染料木素、大豆苷元及黄豆黄素含量的影响，结果如图4所示。在新鲜豆腐黄浆水中大豆异黄酮总量为245.17mg/L，其中糖苷型大豆异黄酮含量为175.12mg/L，这与贺云的结果一致，即大部分大豆异黄酮以结合型糖苷的形式存在。

新鲜豆腐黄浆水经过屎肠球菌R2的发酵作用后，其大豆异黄酮组分的存在形式及含量都发生了变化。结果表明，随着发酵时间的延长，糖苷型大豆异黄酮含量逐渐降低，苷元型大豆异黄酮含量明显升高，这表明屎肠球菌R2能够促进糖苷型大豆异黄酮向苷元型大豆异黄酮转化。发酵36h后，低活性糖苷型异黄酮含量显著减少（P＜0.05），其含量下降到23.40mg/L；其中大豆苷和染料木苷在发酵24h后含量为零，全部转化，而大豆黄素苷的含量变化相对较小；同时，游离型苷元异黄酮的含量显著增加（P＜0.05），由70.05mg/L增加到115.21mg/L；其中大豆苷元含量由25.43mg/L增加至43.17mg/L，染料木素含量由24.90mg/L增加至50.16mg/L，黄豆黄素含量由19.72mg/L增加至21.88mg/L。

发酵24h后染料木苷和大豆苷已被完全转化，但是24h后染料木素和大豆苷元的含量仍在增加（P＜0.05），说明还存在丙二酰染料木苷和丙二酰大豆苷，当原有的染料木苷和大豆苷消耗完以后，这两种丙二酰葡萄糖苷转化成相应的β-葡萄糖苷后又继续向苷元型异黄酮转化。另外，经过屎肠球菌R2的发酵作用，大豆异黄酮总量由245.17mg/L下降到138.60mg/L，可能是因为大豆苷转化成大豆苷元后，在屎肠球菌R2的作用下又进一步转化成雌马酚。雌马酚是大豆异黄酮重要的代谢终产物，由大豆苷元在肠道菌的作用下经特异性代谢得到，具有较异黄酮前体更高的生物活性，且性质稳定，容易被人体吸收。姜雪从女性体内筛选出1株可以转化大豆苷元生成雌马酚的肠道菌屎肠球菌HY-1。因此，屎肠球菌R2很可能也具有将大豆苷元转化成雌马酚的能力。

2.6 屎肠球菌R2β-葡萄糖苷酶的定位及活性分析

研究表明乳酸菌在发酵过程中可促进豆腐黄浆中糖苷型大豆异黄酮向游离苷元型大豆异黄酮转化，这主要是β-葡萄糖苷酶的酶解作用。对屎肠球菌R2发酵过程中不同部位的β-葡萄糖苷酶酶活进行测定，结果如图5所示，可知屎肠球菌R2具有β-葡萄糖苷酶酶活，且不同部位的酶活具有显著差异（P＜0.05）。菌体上清中的β-葡萄糖苷酶酶活几乎为零，破碎沉淀酶活显著高于破碎上清酶活，说明屎肠球菌R2的β-葡萄糖苷酶属于胞内酶，且主要以不可溶性蛋白形式为主。这一结果与张哲的研究一致，其研究发现植物乳杆菌的β-葡萄糖苷酶为胞内酶，主要为处于细胞膜上的不可溶性酶，还有少量存在于原生质体内细胞液中的可溶性酶。由图5可以看出，随着发酵时间的延长，β-葡萄糖苷酶的酶活先增加后稍有下降，在发酵24h时达到最大。

2.7 发酵处理对豆腐黄浆水清除DPPH自由基能力的影响

大豆异黄酮具有很强的抗氧化活性，经过乳酸菌的发酵作用，糖苷型大豆异黄酮转化为苷元型大豆异黄酮，抗氧化活性会进一步增强。图6为发酵黄浆水DPPH自由基的清除能力，由图6可以看出，屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆可显著提高其清除DPPH自由基的能力，发酵36h后，黄浆水DPPH自由基的清除能力由14.20μgＴrolox/mL增加到55.25μgＴrolox/mL。

使用Pearson相关性检验对大豆异黄酮转化与DPPH自由基清除能力进行相关性分析，结果如表5所示。结果显示，游离型苷元大豆异黄酮大豆苷元和染料木素的含量与DPPH自由基清除能力呈显著正相关（P＜0.05），并且染料木素的含量与DPPH自由基清除能力呈极显著正相关（P＜0.01），同时，糖苷型大豆异黄酮大豆苷和染料木苷的含量与DPPH自由基清除能力呈显著负相关（P＜0.05），而大豆黄素苷和黄豆黄素与DPPH自由基清除能力之间不相关（P＜0.05）。说明屎肠球菌R2发酵过程中DPPH自由基清除能力的提高确实与大豆异黄酮的生物转化有关，且主要因为染料木素和大豆苷元含量的增加。

3 结论

对屎肠球菌R2发酵作用对豆腐黄浆水中低聚糖、有机酸和大豆低聚糖含量以及DPPH清除能力的影响进行了研究。结果表明，屎肠球菌R2可以产生α-半乳糖苷酶以利用豆腐黄浆水中的碳水化合物生长产酸，可以有效地降解棉籽糖和水苏糖，产生大量的乳酸、醋酸等有机酸，最终使pH下降到3.6以下；同时，屎肠球菌R2还可以产生β-葡萄糖苷酶将活性低的糖苷型大豆异黄酮（主要为大豆苷和染料木苷）转化为高活性游离型苷元大豆异黄酮，进而显著提高了黄浆水清除DPPH自由基的能力。对α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶进行了初步定位，结果表明两种酶均属于胞内酶，且主要为不可溶性蛋白酶，但是两种酶的确切位置及酶活特性还需进一步研究；另外，经过屎肠球菌R2的发酵作用，所测的大豆异黄酮总量有所下降，因此，在发酵的过程中大豆苷元很可能继续转化为大豆异黄酮代谢终产物雌马酚，其具体的代谢机理仍需进一步探讨。

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