4.2基于成分特有性的四逆散Q-marker预测分析

柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，主要含有皂苷、挥发油、有机酸、黄酮及甾醇类，其中起主要作用的柴胡皂苷属于三萜皂苷类化合物。三萜皂苷类成分主要通过甲戊二羟酸途径合成，由3分子的乙酰辅酶A缩合后，在酶的作用下催化成了含有6个碳原子的甲羟戊酸（MVA），再经过一系列的反应得到了异戊烯焦磷酸（IPP），异戊烯焦磷酸异构化变成了二甲丙烯焦磷酸（DMAPP）；IPP和DMAPP头尾缩合得到了含有10个碳原子的焦磷酸香叶酯（GPP），进一步在法尼基焦磷酸合酶（FPS）的作用下，将IPP与GPP结合产生了含有15个碳原子的法尼基焦磷酸（FPP）；2分子的FPP尾尾缩合，在鲨烯合酶（SS）的催化下生成了反式角鲨烯，再经鲨烯环氧酶（SE）的作用，反式角鲨烯在C-2和C-3的位置环氧化成了2,3-氧化鲨烯；以2,3-氧化鲨烯为底物，经过不同的反应，分别得到了不同的三萜皂苷类化合物，合成途径见图2。

白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。有文献报道白芍的化学成分主要有单萜及其苷类、三萜类、黄酮、鞣质、多糖、挥发油等，其中单萜类成分芍药苷含量较高且药理活性较强。萜类成分主要通过甲戊二羟酸途径合成，单萜类成分经甲戊二羟酸（MVA）数步反应转化成异戊烯焦磷酸（IPP），IPP异构化变成了二甲丙烯焦磷酸（DMAPP），IPP和DMAPP头尾缩合得到焦磷酸香叶酯（GPP），GPP可反应生成单萜类化合物，生物合成途径见图3。

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。枳实的主要化学成分为黄酮类、生物碱及挥发油，尤以黄酮类成分中的橙皮苷和柚皮苷含量较高，可作为指标性成分进行定性定量和提取工艺的研究。黄酮类成分由苯丙氨酸经苯丙氨酸脱氨酶（PAL）转化为肉桂酸，再经肉桂酸-4-羟化酶（C4H）转化为对羟基-香豆素，又通过4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）转化为4-香豆酰辅酶A在查尔酮合成酶（CHS）的作用下生成查尔酮，经查尔酮异构酶（CHI）的作用形成二氢黄酮，其他黄酮类化合物大都是经过二氢黄酮在各种酶的催化作用下生物合成的，其合成途径见图4。

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。研究表明，甘草的化学成分主要包三萜类、黄酮类、多糖、香豆素类、氨基酸、生物碱类、雌激素和有机酸类等化合物。三萜类和黄酮类为其主要有效成分，具有多种药理作用，尤以甘草酸和甘草次酸含量较高，生理活性较强，较具特征性。三萜皂苷类成分生物合成见图2，黄酮类成分生物合成途径见图4。

4.3基于成分与药效关联的四逆散Q-marker预测分析

质量控制的根本目的是对中药有效性的控制，将“药性”和“药效”均纳入中药质量评价，才能反映中药质量的完整性。因此，有效性也是中药质量标志物确定的重要依据。药理学研究表明，柚皮苷、甘草次酸两种物质是四逆散全方抗炎和免疫抑制药效的主要效应成分。戈宏焱通过研究柴胡皂苷对抑郁模型大鼠的作用，发现柴胡皂苷对大鼠海马区的神经具有保护作用，同时能提高核糖核酸（BDNF）含量，提示柴胡皂苷的抗抑郁作用是通过调节脑内神经营养因子完成的。现代研究结果表明，柴胡抗抑郁的功效物质基础主要为皂苷类成分。还有细胞实验发现芍药苷与柴胡皂苷a能有效缓解被皮质酮损伤的PC12细胞中自噬流被抑制的现象，提高细胞自噬活性，从而提高PC12细胞的活性。枳实中的化学成分复杂，其中橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等黄酮类成分均可改善功能性消化不良大鼠的胃排空和小肠推进功能，其作用机制可能与增加胃动素的分泌有关。李越峰通过研究大鼠脑脊液中四逆散的主要活性成分，发现给予四逆散冻干粉后，大鼠脑脊液中成分峰面积约是空白脑脊液峰面积的12.5倍，血清中四逆散的主要活性成分为辛弗林、芍药苷、柴胡皂苷c及甘草次酸，均可以使脑脊液中该内源性物质峰面积高于空白脑脊液峰面积，初步认定四逆散改善睡眠作用的药效物质基础是辛弗林、芍药苷、柴胡皂苷c及甘草次酸混和物。徐甜等对四逆散抗抑郁有效靶点进行挖掘，得到抗抑郁靶点对应的药效组分属于柴胡的有7个，枳实的有12个，甘草的有87个，白芍的有1个。而所得的抗抑郁靶点中，柴胡的靶点有18个，枳实的靶点有11个，甘草的靶点有25个，白芍的靶点有17个。此外，侯磊等采用网络药理学方法对四逆散干预焦虑症作用机制进行探究。结果表明，君药柴胡中槲皮素、山柰酚等成分具有明显的抗焦虑作用，其机制与提高小鼠脑内γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）含量有关；臣药芍药中芍药苷能降低血虚肝郁证模型大鼠环核苷酸（cGMP）含量，可以改善大鼠的抑郁、焦虑与学习记忆障碍等；佐药枳实中橙皮苷是抗焦虑活性成分之一。上述研究表明柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林和甘草次酸均可作为四逆散的主要药效成分。

4.4基于复方配伍环境的四逆散Q-marker的预测分析

配伍是中药复方的核心，复方通过配伍针对病或证的主要病理环节产生治疗作用。卢健等以四逆散及不同配伍对溃疡性结肠炎的干预机制进行研究，实验结果发现与模型组相比，四逆散及不同配伍能不同程度地减轻结肠组织的损伤，并能够促进实验性溃疡结肠炎（UC）大鼠结肠病变组织修复。在促进结肠组织修复方面，柴胡、芍药发挥了君药与臣药的的重要配伍作用，甘草作为使药，其协调作用主要体现在对胸腺细胞增殖的刺激。李越峰等对四逆散拆方过程中化学成分的变化进行了分析研究。结果发现，四逆散中柚皮苷、甘草酸含量高于去柴胡方中的含量；四逆散中芍药苷溶出量明显高于单煎物的溶出量；全方煎煮后，枳实中的柚皮苷、橙皮苷成分溶出量高于单煎物溶出量，且配伍枳实后四逆散中甘草酸含量明显升高；配伍甘草后与去掉甘草相比，芍药苷、橙皮苷、柚皮苷溶出量均有所增多。提示在配伍煎煮过程中，各成分间存在明显的相互增溶作用。李军等采用RP-HPLC法研究四逆散不同配伍对柴胡皂苷a、b2、柴胡总皂苷及甘草素、异甘草素煎出率的影响。结果发现，四逆散不同配伍中，枳实中的成分可提高柴胡皂苷类成分的煎出量；枳实、白芍中的成分对甘草素和异甘草素有增溶作用；柴胡中的成分对甘草素和异甘草素有抑溶作用。然而，全方合煎时各种成分含量均能达到最优，这也是四逆散配伍的巧妙之处。据以上分析可知柴胡皂苷a、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、甘草素可作为四逆散主要药效成分。

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