酱油因其味道鲜美、口感醇厚，成为人们餐桌饮食的重要调味品。目前，国内外的酱油酿造工艺主要有低盐固态工艺和高盐稀态工艺两种。低盐固态发酵工艺最初是为了改善无盐固态发酵酱油的风味而提出的，此工艺具有发酵温度高、能够抑制杂菌、原料利用率高和生产稳定的优点，并且周期较短、易于大规模生产，是我国大部分酱油生产企业主要釆用的发酵工艺。但是相较于高盐稀态发酵工艺，酶作用周期比较短，酯香味不足，生产的酱油以中低档为主。

高盐稀态发酵工艺是把原料经过蒸煮或焙炒、制曲后与20%左右的盐水混合成酱醪，经过发酵制成酱油。该工艺虽然周期长、原料利用率低，但是后发酵充分、味醇香浓，是厂家生产高档酱油的首选工艺。但是高盐稀态酱油中较高的盐浓度（18%～22%）存在引发高血压、心血管等疾病的潜在危险，可能会影响人体健康。食品法典委员会（codexalimentariuscommission,CAC）建议将饮食中盐的摄入量从9g/d减少到6g/d，世界卫生组织（worldhealthorganization,WHO）和粮食及农业组织（foodandagricultureorganization,FAO）建议每日盐摄取量不超过5g/d。所以食用低盐发酵酱油已成为一种趋势，提高低盐发酵酱油的品质已成为行业内亟待解决的问题。

酱油发酵是典型的混菌发酵过程，多种微生物参与其中并发挥作用，主要有曲霉、酵母菌、乳酸菌以及其他细菌，其中酵母菌和乳酸菌在酱油发酵过程中发挥重要作用。鲁氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）、埃切假丝酵母（Candidaetchellsii）和易变球拟酵母（Torulopsisversatilis）与酱油发酵的关系最为密切，其中研究和应用最多的是鲁氏接合酵母。鲁氏接合酵母是酱醪中的优势微生物，主要作用于酱油发酵前期，除了能生成多种醇类，还能参与含硫化合物等风味物质的形成，带给酱油更加复杂和醇厚的香气。目前，人工添加鲁氏接合酵母的效果明显、技术成熟，并受到了一致认可。

乳酸菌种类多、总量大，能够发酵葡萄糖生成酸类物质，是影响酱油发酵的重要微生物。嗜盐四联球菌（Tetragenococcushalophilus）是一类参与酱油发酵的耐盐乳酸菌。嗜盐四联球菌具有多种氨肽酶，能参与氨基酸的次级代谢和醇醛之间的转化。在酱油生产过程中强化嗜盐四联球菌和酵母菌，能通过菌株间的协同作用使酱油风味更加丰富。已有研究表明，添加两种酵母菌（Z.rouxii和皱状假丝酵母（Candidaversatilis））和嗜盐四联球菌可使酱油中醇类、酯类、酸类和吡嗪类等物质含量显著增加，挥发性物质总量提高2.2倍。嗜盐四联球菌对低盐酱油防腐有着一定的积极意义，其能够利用葡萄糖产生高浓度乳酸。乳酸不仅能赋予酱油柔和的酸味，而且酱油发酵过程中维持一定浓度的乳酸能有效抑制巨大芽胞杆菌（Bacillusmegatherium）为主的酱油变质胀瓶污染菌，有利于成品酱油的质量安全。另外，嗜盐四联球菌还能减少胺类危害物的含量。

研究发现，酵母菌和乳酸菌在酱醪中存在通过物质代谢产生的拮抗作用，乳酸菌和酵母菌的添加需要有一定的间隔期，并且其添加量对酱醪发酵也有显著影响。本研究以通过模拟低盐酱油快速发酵，在添加鲁氏接合酵母的基础上，考察嗜盐四联球菌不同添加量对酱醪理化指标、氨基酸和有机酸含量、挥发性风味物质等的影响，揭示其发酵功能，为提高低盐发酵酱油品质提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

酱油曲精（米曲霉（Aspergillusoryzae）沪酿3.042）：久味食品科技有限公司；嗜盐四联球菌R44、鲁氏接合酵母ZQ02：分离自新鲜酱醪，保存于本实验室。

1.1.2培养基

嗜盐四联球菌培养基采用MRS肉汤培养基：英国Oxoid公司。使用时添加NaCl100g/L,pH7.0。固体培养基中添加琼脂20g/L。

鲁氏接合酵母培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeastextractpeptonedextrose,YPD）：北京索宝来科技有限公司。使用时添加NaCl50g/L,pH5.0。固体培养基中添加琼脂20g/L。

嗜盐四联球菌计数培养基采用MRS固体培养基：英国Oxoid公司。使用时添加纳他霉素0.1g/L、NaCl100g/L,pH7.0。

酵母菌计数培养基[5]采用孟加拉红固体培养基：青岛宝博生物科技有限公司。使用时添加丙酸钠5g/L、NaCl100g/L,pH5.0。

以上培养基均115℃灭菌30min。

1.1.3试剂

酵母膏、胰蛋白胨（均为生化试剂）：英国Oxoid公司；氨基酸标样、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde,OPA）（色谱纯）：美国Agilent公司；纳他霉素（纯度96%）：青岛宝博生物科技有限公司。

1.2仪器与设备

867pH计、ME204电子天平：瑞士Mettler-Toledo公司；MultiskanFC酶标仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；PegasusGC-HRT4D+气相-高通量飞行时间质谱仪：美国力可公司；UV-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；1260高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）仪：美国安捷伦公司。

1.3方法

1.3.1菌株培养

嗜盐四联球菌的培养：从甘油管中取适量嗜盐四联球菌菌液，接种至嗜盐四联球菌固体培养基，30℃活化培养5d。从活化平板上挑取单菌落接种到嗜盐四联球菌液体培养基中，30℃静置培养60h，按1%(V/V）的接种量接种至嗜盐四联球菌液体培养基，30℃静置培养至OD600nm值达到1.2（菌体浓度1.2×10⁸CFU/mL），备用。

鲁氏接合酵母的培养：从甘油管中取适量鲁氏接合酵母菌液，接种至鲁氏接合酵母固体培养基，30℃活化培养2d。从活化平板上挑取单菌落接种到鲁氏接合酵母液体培养基中，30℃、220r/min培养30h，按1%(V/V）的接种量接种至鲁氏接合酵母液体培养基，30℃、220r/min培养至OD600nm值达到4.0（菌体浓度6.4×10⁷CFU/mL），备用。

1.3.2模拟低盐酱油快速发酵工艺

制曲工艺：将黄豆粉和1.2倍的水混合均匀后在121℃下灭菌15min，冷却至室温后，把黄豆粉、炒熟的小麦粉（质量比为6∶4）和酱油曲精（原料总质量的1.5‰）充分拌匀。在生化培养箱中30℃培养48h，适时翻曲，曲料表面长满菌丝即为成曲。

发酵工艺：将成曲用研钵碾碎，与盐水（100g/LNaCl）以体积比1.0∶2.5混合。将混合后的酱醪分装入2L坛子中，30℃发酵30d，期间每天搅拌一次。在发酵第0、5、10、15、20、25和30天进行取样。

菌株的添加方式及添加量：模拟低盐酱油快速发酵过程菌株的添加方式及添加量见表1。发酵开始时（pH5.2左右）添加10⁷CFU/g鲁氏接合酵母ZQ02(Z)。嗜盐四联球菌添加时间为发酵10d，添加量分别为10⁶CFU/g(Z+T(10））、10⁷CFU/g(Z+10×T(10））、10⁸CFU/g(Z+100×T(10））。

1.3.3嗜盐四联球菌和酵母菌数量的测定

采用平板计数法测定嗜盐四联球菌和酵母菌数量。称取1g新鲜酱醪和99mL生理盐水混匀，梯度稀释后涂布到计数培养基上，30℃培养3～6d进行计数。嗜盐四联球菌为兼性厌氧菌，菌落较小，平板培养需要4～6d。因此，MRS平板计数时可以和酱醪中优势耐盐细菌（包括魏斯氏菌（Weissella）、芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus））区分。本方法所计算的酵母数量包括添加的鲁氏接合酵母以及酱醪中的其他耐盐酵母，后者与前者相比数量较少，可忽略不计。

1.3.4酱醪理化指标的测定

取100g酱醪，12000r/min离心30min，用孔径为0.22μm的滤膜过滤上清液后进行测定。酱醪pH值采用精密pH计测定。总酸含量采用酸度计法测定。还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法（3,5-dinitrosalicylicacid,DNS）测定。氨基酸态氮含量采用甲醛滴定法测定。

1.3.5酱醪游离氨基酸的测定

游离氨基酸采用高效液相色谱法测定，采用OPA进行柱内衍生化，具体测定方法参照文献。

1.3.6酱醪有机酸的测定

有机酸采用高效液相色谱法测定，具体方法参考文献。

1.3.7酱醪挥发性风味物质的测定

挥发性风味物质采用顶空固相微萃取（headspacesolidphasemicro-extraction,HS-SPME）联合气质联用技术（gaschromatography-massspectrometer,GC-MS）进行测定，具体方法参考文献。测定后将样品质谱图与美国国家标准与技术研究院（nationalinstituteofstandardsandtechnology,NIST)2.0标准谱库比对鉴定，根据保留指数（retentionindex,RI）对挥发性物质进行定性，根据内标2-辛醇（83.36μg/L）的峰面积对挥发性物质进行半定量分析。

1.3.8数据处理方法

利用Excel2012、SPSS19.0对数据进行处理分析，利用Origin8.5、R语言和AdobeillustratorCS6对数据可视化。所有试验均重复3次，结果采用“均值±标准差”的形式展示。

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