2.2.4 加热时间的影响

为探究加热时间对显色的影响，1 mL 64 mg·L^-1的 GABA水溶液、1 mL pH=7磷酸缓冲溶液和2 mL 1.8 g·L^-1的水合茚三酮醇溶液，混匀定容后，100℃下沸水浴不同时间，冷却后用水定容至5 mL摇匀，测567 nm处的吸光度。由图2 d可知：吸光度随加热时间延长整体呈增加趋势。加热时间小于10 min时，吸光度很小，说明显色产物的量极少，反应很不完全；沸水浴10～40 min时，吸光度随加热时间迅速增加，超过40 min后增加的趋势明显减缓。这说明水合茚三酮与GABA反应需要加热时间足够，显色反应才能完全，本文确定60 min为最佳显色加热时间。

2.3 茚三酮显色法测定GABA的性能评价

2.3.1 线性范围和检出限

以试剂空白为参比，对不同浓度的GABA在优选条件下经水合茚三酮显色后测定，以吸光度对GABA的浓度作图，得水合茚三酮显色测定GABA的工作曲线。对结果进行拟合，结果表明：在0.5～80 mg·L^-1的浓度范围内，吸光度(y)与GABA浓度(x)符合方程 y=0.01234x-0.00113，R2=0.99983，线性较好。根据三倍标准偏差计算得到该方法测定GABA的检出限为21.6 μg·L^-1，灵敏度较高。

2.3.2 重现性与抗干扰实验

良好的重现性是进行准确分析测定的前提。通过水合茚三酮显色，对相同浓度的GABA溶液进行7次平行显色，每份重复测定3次。经计算可知，平均吸光度的相对标准偏差为0.026%，说明该方法精密度高，重现性好。

一定的选择性是保证分析结果准确度的关键。为此，本文通过对比40 mg·L^-1 GABA在加入不同干扰物前后的吸光度值变化来研究该方法的抗干扰能力。干扰物的选择主要是样品中可能存在的共存组分和根据显色原理可能会干扰的一些物质。首先分别测定40 mg·L^-1 GABA水溶液和相同GABA浓度但添加有不同浓度干扰物的混合液显色后的吸光度，然后以不加干扰时的吸光度值为分母，以添加干扰物后的吸光度为分子，计算所得比值可表示加入干扰后吸光度的相对变化。比值越接近1，说明该物质干扰越小。由图3知，加入1.5 mg·L^-1淀粉(Starch)、15 mg·L^-1聚乙二醇8000(PEG 8000)、45 mg·L-1 Fe3+、30 mg·L-1 Fe2+、15 mg·L^-1氯化亚锡和15 mg·L^-1二氧化铈时的比值都在0.97～1.02之间，说明上述干扰物对茚三酮显色法测定40 g·L^-1 GABA的干扰较小，相对误差不超过3%，该方法具有一定的抗干扰能力。

2.4 样品测定和结果确认

为避免样品中可能存在的其他氨基酸或蛋白质等对测定结果的影响，将含有GABA的食品添加剂配成100 mg·L^-1 的水溶液，再对其进行薄层色谱分离，取相应斑点溶解后，在选定条件下测吸光度，计算出GABA的浓度为45.51 mg·L^-1，即GABA在样品中含量为45.51%。

为检验样品测定结果的准确性，进行了三个不同浓度的加标回收实验，结果如表1所示，加标回收率在95.4～117.6%范围内，说明准确度较好。

此外，为进一步检验样品测定结果的准确性，排除薄层色谱未将GABA与其他氨基酸分离的可能，将2.5 g·L^-1 GABA、0.25 g·L^-1 L-苯丙氨酸和0.25 g·L^-1L-组氨酸的混合液在相同色谱条件下分离，结果如图4所示。1号位为L-组氨酸，2号位为GABA，3号位为L-苯丙氨酸，这说明在此条件下GABA可被有效分离。

综上可知，利用本文所建立的方法可较准确地测定GABA的含量。

3 结论

基于目前文献报道的水合茚三酮显色测定氨基酸的条件有明显差异，考虑到氨基酸结构不同可能导致显色条件和测定波长不同，本文针对在食品和医药领域具有重要研究意义的GABA，研究了不同溶剂、显色酸度、显色剂用量、显色温度和时间等因素对水合茚三酮与GABA显色反应的影响，发现在pH=7.0时，0.5 mg·L^-1～80 mg·L^-1浓度范围内的GABA与1.8 g·L^-1水合茚三酮乙醇溶液沸水浴60 min， 反应生成的有色产物在567 nm处的吸光度与GABA浓度线性关系良好，确立了一种利用水合茚三酮定量测定GABA的简单方法。实验证明，该方法有较好的重现性和一定的选择性，结合薄层色谱对实际样品进行分析和结果验证，准确度较高。本文所建立的方法不仅可直接用于一些样品中GABA的定量检测，也可作为液相色谱的检测手段，这在当前GABA被日益广泛关注和大量应用的情况下具有重要意义。

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