一、目的要求

1、掌握微生物检验的一般方法。

2、学会果蔬中致病性大肠杆菌的测定方法。

二、实验原理

根据大肠杆菌在一定条件下能发酵乳糖、产酸产气，以及生化指标和血清学特征做出综合判断。

三、实验试剂与仪器

1．培养基和试剂

①乳糖胆盐发酵管：将20g蛋白胨、5g猪胆盐(或牛、羊胆盐)及10g乳糖溶于水中，校正pH至7.4，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。

②营养肉汤：将10g蛋白胨、3g牛乳膏及5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，校正pH至7.4，分装烧瓶，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。

③肠道菌增菌肉汤：将10g蛋白胨、5g葡萄糖、20g牛胆盐、8g磷酸氢二钠、2g磷酸二氢钾、0.015g煌绿溶于少量热水中，然后稀释至1000mL蒸馏水中，校正pH至7.2。分装每瓶30mL，115⁰C高压灭菌锅15min。

④麦康凯琼脂：将17g蛋白胨、3g脉胨、5g猪胆盐(或牛、羊胆盐)及5g氯化钠溶解于400mL蒸馏水中。校正pH至7.2。将17g琼脂加入600mL蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧杯内，121⁰C高压灭菌15min，备用。临用时加热溶化琼脂，趁热加入10g乳糖，冷至50～55℃时加入10mL 0.01％结晶紫和5mL0.5％中性红水溶液，摇匀后倾注平板。

⑤伊红美蓝琼脂(EMS)：将10g蛋白胨、2g磷酸氢二钾和17g琼脂溶解于1000mL蒸馏水中，校正pH至7.1，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。临用时加入10g乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

⑥三糖铁琼脂(TSI)：将20g蛋白胨、5g牛肉膏、10g乳糖、10g蔗糖、lg葡糖糖、5g氯化钠、0.2g硫酸亚铁铵及0.2g硫代硫酸钠溶于1000mL蒸馏水中，校正pH至7.4。加入12g琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.025g 0.2％酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高档的底层。121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。

⑦克氏双糖铁琼脂(KI)：取两份500mL血消化汤(pH=7.6)，分别加入6.5g，2g琼脂，加热溶解。第一份作为上层培养基，第二份作为下层培养基。在上层培养基中加入0.1g硫代硫酸钠、O.1g硫酸亚铁铵、5g乳糖及5mL0.2％酚红溶液，分装于烧瓶内；在下层培养基中加入1g葡萄糖及5mL0.2％酚红溶液，分装于12mm×100mm灭菌试管内，每管约2mL，115℃高乐灭菌10min。将上层培养基放在56％：水浴箱内保温；将下层培养基直立放在室温内，使其凝同。待下层培养基凝固后，以无菌手续将上层培养基分装于下层培养基的上面，每管约1.5mL，放成斜面。

⑧糖发酵管：将10g蛋白胨、5g牛肉膏、3g氯化钠、2g磷酸氢二钠及12mL0.2％溴麝香草酚蓝溶液溶于1000mL蒸馏水中，校正pH至7.4。按0.5％加入所需糖类(如乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)，分装于有一个倒置小管的小试管内，12l⁰C高压灭菌15min。

⑨赖氨酸脱酸酶试验培养基：将5g蛋白胨、3g酵母浸膏、1g葡萄糖及1mLl.6％溴甲酚紫-乙醇溶液溶于少量热水，然后稀释至1000mL蒸馏水中，分装每瓶100mL，分别加入各种所需氨基酸。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加上一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。

⑩尿素琼脂：将1g蛋白胨、5g氯化钠、1g葡萄糖、2g磷酸二氢钾及3mL0.4％酚红溶液溶于1000mL蒸馏水中，并校正pH至7.2±0.1，加入20g琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121℃高压灭菌15min。冷至50～55℃，加入经除菌过滤的100mL 20％尿素溶液。尿素的最终浓度为2％，最终pH应为7.2±0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。

2、仪器

采样箱；灭菌搅拌棒；灭菌勺子、镊子等；灭菌具塞广口瓶；灭菌塑料袋；酒精灯；冰箱；恒温培养箱；恒温水浴锅；显微镜；离心机；酶标仪；均质器(或灭菌乳钵)；架盘药物天平；细菌浓度比浊管；灭菌广口瓶；灭菌锥形瓶；灭菌吸管；灭菌培养皿；灭菌试管；注射器；灭菌刀、剪、镊子等；小白鼠；硝酸纤维素滤膜(150mm×50mm，0.45μm)，灭菌备用。

四、实验步骤

1、增菌

样品采集后应尽快检验，除易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。以无菌手续称取检样25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN值，其余的移入500mL广口瓶内，于(36±1)℃培养6h，取出一接种环，接种于一管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42⁰C培养18h。

2、分离

将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板。

污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种伊红美蓝琼脂平板，于(36±1)℃培养18-24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意不发酵和迟缓发酵的菌落。

3、生化试验

①自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种于三糖铁琼脂或克氏双糖铁琼脂上，同时将这些培养物分别接种于蛋白胨水、半固体琼脂、pH=7.2的尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36⁰C培养过夜。

②TSI斜面产酸或不产酸、底层产酸，H₂S阴性、KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希菌。

TSI底层不产酸，或H₂S、KCN和尿素等试验中有任一项为阳性培养物，均非大肠埃希菌。

必要时可做氧化酶试验和革兰染色。

4、血清学试验

①挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希菌、侵袭性大肠埃希菌和产肠毒大肠埃希菌多价0血清和出血性大肠埃希菌0157血做玻片凝集试验。当与某一种多价血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一单价0血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。

致泻性大肠埃希菌所包括的0抗原群有EPEC、EHEC(如0157)、EIEC和ETEC诸类群，参见有关致泻性大肠埃希菌的0抗原菌群。

②证实试验：制备0抗原悬液，稀释至与MacFarland 3号比浊管相当浓度。原效价为1:600～1:320的0血清，用0.5％盐水稀释至1:40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm的管内等量混合，做单凝集试验。混匀后放入50⁰C水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该0抗原。

五、结果报告

综合生化试验、血清学试验作出报告。

六、注意事项

细菌的分裂是无规律的，因此为了获得足够的统计准确度，要求进行5管平行试验。

参考资料：食品中有毒有害物质检测

相关链接：大肠杆菌，乳糖胆盐发酵管，麦康凯琼脂，伊红美蓝琼脂