银杏（Ginkgobiloba）为银杏科银杏属植物，是我国特有的中生代孑遗树种。银杏种仁（白果）为卫计委认定的药食同源物质，具有益气、润肺和定喘等功能。银杏营养成分丰富，干制品中蛋白含量13.2%，碳水化合物含量72.6%，粗脂肪含量1.3%，此外还含有丰富的维生素E及多种矿质元素。银杏蛋白以清蛋白和球蛋白为主，氨基酸组成合理，必需氨基酸占比高，属于优质植物蛋白。邓乾春等研究表明，银杏白蛋白具有较好的清除超氧阴离子和拮抗DNA氧化损伤的活性，银杏清蛋白可通过免疫调节和抗氧化能力发挥对衰老小鼠、免疫抑制小鼠和S180肿瘤小鼠的保护作用。

植物蛋白的提取有物理压榨和溶剂浸提法等，其中溶剂浸提法是最常使用的方法。溶剂浸提法主要有水提酸沉法（waterextractionandacidprecipitation,WEAP）、碱提酸沉法（alkaliextractionandacidprecipitation,AEAP）和盐提盐析法，以及各种辅助提取技术，如超声辅助提取、微波辅助提取、酶辅助提取、反胶团萃取和双水相萃取等。目前已有数篇关于银杏蛋白提取工艺的研究报道，李盼盼等优化了银杏蛋白超声辅助提取的工艺参数，贾韶千等报道了银杏蛋白碱法提取的最佳工艺，陈西娟考察了银杏蛋白的盐提盐析法的工艺条件。研究表明功能活性物质的结构、理化性质和生物活性会受到提取方法的影响。彭倩等发现碱提酸沉法和盐溶法提取的腰果蛋白的结构和功能特性具有显著性差异。职士淇等研究表明超声辅助碱提、盐提和水提制备的青叶苎麻叶蛋白质的功能特性各有优劣。有关提取方法对银杏蛋白功能特性和抗氧化活性的研究未见报道。

本研究采用WEAP、AEAP和超声辅助碱提酸沉法（ultrasound-assistedalkaliextractionandacidprecipitation,UA-AEAP）三种方法制备银杏蛋白，考察提取方法对银杏蛋白溶解度、起泡性、起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性等功能特性的影响，同时考察提取方法对银杏蛋白螯合亚铁离子能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基能力和清除羟基自由基能力的影响，旨在为银杏蛋白资源的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜银杏2020年10月采自江苏邳州；牛血清白蛋白、DPPH、十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）、菲啰嗪美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。FA2104N电子分析天平、723C可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪济南海能仪器股份有限公司；LGJ-18A冷冻干燥机北京四环科学仪器厂；TGL-16G型台式离心机上海安亭科学仪器厂；SHZ-D（Ш)循环水式真空泵郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

新鲜银杏去外种皮、脱壳后，60℃下烘干至恒重，粉碎过60目，加入4倍体积石油醚，浸泡24h脱脂，得到脱脂银杏粉。

1.2.2 银杏蛋白的制备

根据预实验结果确定了不同提取方法的工艺参数。WEAP提取条件：取50g脱脂银杏粉，按液料比20:1mL/g分别加入去离子水，提取温度60℃，提取时间2h。AEAP提取条件：按液料比20:1mL/g将脱脂银杏粉与NaOH溶液混合，调pH10.0，提取温度60℃，提取时间2h。UA-AEAP工艺参数：液料比20:1mL/g，超声功率200W，超声处理时间20min，提取温度60℃，提取时间40min。提取后，3500r/min离心20min，收集上清液，调pH至银杏蛋白的等电点4.4，4500r/min离心20min，所得沉淀透析（截留相对分子质量3500Da）72h，浓缩，冷冻干燥，得银杏蛋白。

1.2.3 银杏蛋白得率及其化学成分的测定

蛋白含量的测定：GB50095-2016凯氏定氮法；总糖含量的测定：苯酚硫酸法；粗脂肪含量的测定：5009.6-2016索氏抽提法；灰分含量的测定：GB5009.4-2016重量分析法。

银杏蛋白得率计算公式如下：

1.2.4 银杏蛋白溶解度的测定

将100mg银杏蛋白溶于20mL去离子水中，调pH为2～12，室温下搅拌30min，4500r/min离心20min，收集上清液。考马斯亮蓝法测定上清液中银杏蛋白的含量。

1.2.5 起泡性和泡沫稳定性的测定

定取500mg银杏蛋白分散于15mL0.01mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中，记录初始体积为V₁（mL），10000r/min均质2min，记录泡沫体积为V₂（mL），静置30min记录体积记为V₃（mL）。银杏蛋白起泡性和泡沫稳定性的计算公式如下：

1.2.6 乳化性和乳化稳定性的测定

取200mg银杏蛋白分散于20mL0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中，室温下搅拌30min，加入5mL大豆油，10000r/min均质2min。吸取100μL乳液，加入5mLSDS，混匀，测定500nm处的吸光度。银杏蛋白乳化性和乳化稳定性的计算公式如下：

式中：N为稀释倍数；A₁和A₂分别为0和30min时的吸光度；c为蛋白浓度，g/mL；θ为乳液中油相体积分数；Δt为两次吸光度测定的间隔时间，min。

1.2.7 亚铁离子螯合能力测定

采用Decker报道的方法，并稍加修改。将1mL银杏蛋白溶液（0.01～10g/L）与3.7mL55%（v/v)乙醇、0.1mL氯化亚铁（2mmol/L）和0.2mL菲啰嗪（5mmol/L）混匀，静置20min，测定562nm处的吸光度。55%乙醇代替样液作为空白对照。EDTA（0.01～10g/L）作为阳性对照。亚铁离子螯合率计算公式如下：

亚铁离子螯合率(%)=(A_b-As)/A_b×100式（6）

式中：A_b和As分别为空白对照组和样品组的吸光度。

1.2.8 DPPH自由基清除能力测定

参考Wu等报道的方法。取1.5mL银杏蛋白溶液（0.1～6g/L），加入1.5mLDPPH溶液（0.2mmol/L），混匀，室温下置于暗处30min，测定517nm处的吸光度。抗坏血酸（0.05～4g/L）做阳性对照。

式中：Ac为1.5mL蒸馏水与1.5mLDPPH混合液的吸光度；As为1.5mL样液与1.5mLDPPH混合液的吸光度；A_b为1.5mL样液与1.5mL95%乙醇混合液的吸光度。
 

相关链接：石油醚，菲啰嗪，抗坏血酸，磷酸盐

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