金银花来源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThumb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒，疏散风热的功效。历代对金银花的炮制方法主要有炒黄、炒炭、蜜炙等。《中国药典》2015年版仅收载了金银花，但山东、天津、上海、安徽、江西、广东、广西等省市炮制规范均收载了金银花炭。金银花炒炭后寒性减弱，并具有涩性和止血作用，善清解下焦及血分之热毒。

现代研究表明，金银花主要含有有机酸类、黄酮类等多种活性成分，有机酸类成分主要有绿原酸、异绿原酸、咖啡酸等，黄酮类成分主要有槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷、木犀草素等。绿原酸具有抗菌、解热、抗炎作用，咖啡酸具有抗炎、止血作用，槲皮素可降低小鼠出凝血时间，木犀草素具有抗炎、止血作用。金银花炒炭后绿原酸含量明显降低，咖啡酸、槲皮素、木犀草素3种止血成分的含量显著增加。金银花炭品混悬液、水煎液较其生品止血作用更显著，临床多用于治疗各科出血性疾病。但目前对金银花炭止血作用的研究，多以正常动物或体外实验为主，止血机制尚不清楚。本实验参阅文献，从血热出血模型大鼠的一般体征变化、体温改变、凝血功能指标以及胃出血和损伤情况等方面，研究金银花炒炭前后凉血止血作用变化。

1仪器与材料

1.1仪器

AYW8000半自动凝血分析仪(南京瑞麦科技开发有限公司)；H3-18KR型低温冷冻离心机(湖南可成仪器设备有限公司)；MK-30型电热控温炒药机(江阴市祝塘明科机械厂)；FA2004型电子天平(十万分之一，上海上平仪器有限公司)；D4-6050型真空干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2药品与试剂

金银花购自山东建联嘉盛中药饮片有限公司，经山东中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾。金银花炭：按课题组前期优选出的炒炭工艺制备。取净金银花，置电热控温炒药机内(设定炒制温度为250℃，炒制4min，炒药机转速为40r/min)，成品表面焦褐色，具焦香气，得率80.78%。

云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号Z53020798)；干酵母(安琪酵母股份有限公司)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司，批号F20170614)；枸橼酸钠(天国药集团化学试剂，批号20170327)；其余化学试剂均为分析纯。试剂盒：凝血酶原时间(PT，批号20171030)、凝血酶时间(TT，批号20171030)、活化部分凝血活酶时间(APTT，批号20171030)，均购置于南京建成生物工程研究所；其余试剂均为分析纯。

1.3动物

SD雄性大鼠，体重180～220g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物饲养许可证号：SCXK(鲁)20140007。

2方法

2.1供试液的制备

2.1.1大鼠灌胃液的制备

称取金银花炭粗粉300g、金银花粗粉368.41g(按得率计算，相当于炒金银花炭300g)，加10倍量水浸泡30min，回流提取30min，滤过；药渣再加8倍量50%乙醇回流提取30min，滤过；药渣再加乙醇回流提取30min，滤过；合并3次滤液，减压浓缩成浸膏。取浸膏，加入0.5%CMC-Na溶液超声溶解，制成质量浓度为0.60g/mL的大鼠灌胃液。

2.1.2干酵母混悬液的制备

取干酵母20g，加蒸馏水，研磨均匀，定容至100mL容量瓶中，制成浓度为20%的酵母混悬液，现用现配。

2.1.3云南白药混悬液的制备

精密称取云南白药粉末6.25g，研磨均匀，加入0.5%CMC-Na溶液配制成0.025g/mL的云南白药混悬液。

2.2分组、造模及给药

取SD雄性大鼠，置于温度为18～25℃、相对湿度为45%～75%的动物饲养房环境中适应性5天。分组前剔除不正常体温(小于36.5℃或大于38.5℃)或连续两次测体温波动大于0.5℃的大鼠，然后随机分为5组，分别为空白组、模型组、云南白药组、金银花组、金银花炭组，每组10只。空白组自由饮水，其余各组以5%乙醇代替自由饮水，连续7天。第8天开始灌胃，给药组分别灌胃给予金银花生品与炭品灌胃液，空白组与模型组灌胃给予等体积的0.5%CMC-Na溶液，云南白药组灌胃给予云南白药混悬液(给药剂量见表1)，每日2次，连续给药7天，于第13天，空白对照组于背部两侧皮下注射等量生理盐水，其余各组于背部两侧皮下注射20%的干酵母混悬液，注射剂量为10mL/kg。

2.3一般体征观察

2.3.1大鼠体重增长率测定

分别于实验第7天和第14天，测定各组大鼠的体重并计算各组体重增长率。

体重增长率(%)=(第14天体重-第7天体重)/第7天体重×100%

2.3.2大鼠饮食量、饮水量测定

实验第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混悬液后，将各组大鼠的饮食量、饮水量进行48h检测，并计算各组大鼠每100g体重的饮食量和饮水量，取其平均值。

2.3.3大鼠粪便含水量测定

实验第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混悬液2h后，对各组每只大鼠取新鲜粪便1粒，称其湿重，置烘箱105℃干燥5h后，冷却至恒重，称其干重，并计算粪便含水量，取其平均值。

粪便含水量(%)=[(湿重-干重)/湿重]×100%

2.3.4大鼠肛温测定

实验第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混悬液后检测各组大鼠的肛温变化，每隔2h测1次，连续测定5次。

2.4大鼠血液内外源性凝血功能指标测定

实验第14天，大鼠灌胃给药1h后，将各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠1∶9(V∶V)抗凝，全血以3000r/min离心10min，取血浆，测定血浆内外源性凝血功能指标(PT、APTT、TT)。PT、APTT、TT各指标按照试剂盒的操作步骤进行测定。

2.5大鼠胃出血及损伤情况观察

实验第14天，大鼠取血后处死，剖腹取胃组织，用生理盐水冲洗，浸于10%福尔马林溶液中，肉眼观察胃黏膜出血及损伤情况并拍照。

2.6实验数据的统计学处理

采用SPSS22.0统计分析软件对实验数据进行组间t检验及方差分析，实验数据以x¯±s表示，P<0.05有统计学意义。

3结果

3.1金银花炒炭前后对血热出血模型大鼠体重增长率、饮食量、饮水量、粪便含水量的影响

模型组组与空白对照组相比，大鼠体征发生了一系列变化，包括体重减轻，饮食量减少，饮水量增加，粪便含水量降低，大便颜色较黑，且干结颗粒变小，精神状态较活跃，毛色干枯变黄，部分大鼠鼻内及耳蜗深处有出血现象。各给药组与模型组比较，大鼠体重、饮食量均增加，饮水量减少，粪便含水量增加，大便稍软，活动量相对减少，毛色好转，大鼠鼻内及耳蜗深处出血消失。记录并分析各组大鼠给药后一般体征变化。结果见表1。

3.2金银花炒炭前后对血热出血模型大鼠体温的影响

大鼠背部两侧皮下注射20%的干酵母混悬液，并结合无水乙醇的化学刺激作用，可引起大鼠肛温在第2h后明显升高，与空白组相比，模型组大鼠发热过程稳定，能8h维持高温，说明热证模型复制成功。与模型组相比，阳性组无明显差别，表明云南白药在大鼠体温调节中枢中不起调节作用；金银花组和金银花炭组均能显著抑制酵母菌导致的大鼠体温升高，但金银花组优于金银花炭组，表明金银花生品的凉血作用强于炭品。结果见表2。

4讨论

中医理论认为，血热妄行出血是指热邪侵入体内，致气分热、血分热，血热则郁结、互搏，血盛则瘀，则出血，为临床常见疾病。本实验采用5%乙醇长时间化学刺激大鼠胃，导致大鼠胃粘膜灼烧制造出胃出血模型，并结合传统的皮下注射干酵母混悬液制造出血热模型，能够避免采用乙醇造模法所致大鼠醉酒状态，并且造模期间一直饮用5%乙醇，大鼠体内对乙醇有适应的过程，致使模型组大鼠和空白组大鼠的体内代谢成分有较大的差异，在这一点上选择的血热出血动物模型更为合理。

本实验采用干酵母结合乙醇建立大鼠血热出血模型，探究金银花生、炭品对血热出血模型大鼠体重增长率、饮食量、饮水量、粪便含水量、肛温、PT、APTT、TT及其胃组织出血和损伤的影响。结果表明，金银花和金银花炭均能显著增加血热出血模型大鼠体重和饮食量，降低模型大鼠饮水量、粪便含水量和直肠温度，起到体温中枢调节作用，其中，以生金银花降温作用更为显著；金银花炭可明显缩短血热出血模型大鼠PT、APTT及TT，改善血热出血模型大鼠胃出血和胃溃疡情况，其作用显著强于金银花生品。本研究结果表明，生金银花凉血作用较强，止血作用较弱，炒炭后凉血作用减弱，止血作用增强。

PT反映外源性凝血系统，APTT反映内源性凝血系统，TT反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白、内外源共同性凝血系统是否存在抗凝和纤溶亢进。金银花炭可明显缩短血热出血模型大鼠PT、APTT及TT，说明金银花炭的止血机制可能是通过影响内外源性凝血系统起作用的。

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