吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone，PQQ)是一种不同于烟酰胺核苷酸(NAD⁺和NADP⁺)和黄素核苷酸(FAD和FMN)的新有机辅酶，上世纪60年代在研究非磷酸化细菌的葡萄糖代谢过程中被首次发现。从微生物到人体组织，PQQ在自然界的分布范围极广。动物和人类通过饮食途径获取PQQ以满足机体需要。PQQ具有极其独特的理化性质，其促生长、抗应激和在动植物发育繁殖方面的营养作用越来越受到重视。目前对于PQQ主成分的含量测定方法较多，但测定PQQ中杂质的方法鲜有报道，本文通过实验研究建立了HPLC法测定PQQ中咪唑并吡咯喹啉(IPQ)杂质含量的方法。

一、材料与方法

1、仪器与材料

Agilent1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；METTLER-TOLEDOXS205DU型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；乙腈(上海星可高纯试剂有限公司)；磷酸氢二钾(国药集团化学试剂有限公司)；四丁基溴化铵(阿拉丁)；磷酸(ScharlabS.L)；PQQ及IPQ对照品为自制；PQQ样品为自制(批号为17901、17902、17903)。

2、色谱条件

TCIKaseisorbLCODS2000色谱柱(4.6mm×150mm，5lxm)；流动相为乙腈-缓冲溶液(配制10mmol的磷酸氢二钾和15mmol的四丁基溴化铵水溶液，用磷酸调节pH至7.4)[28:72]；紫外检测器，检测波长为259nm；流速为1.0mL／min；进样量为20μL。

3、溶液配制

对照品溶液：精密称取PQQ对照品适量，用稀释剂(乙腈-水=[1:3])定量稀释制成每lmL中约PQQ 0.1μg的溶液。供试品溶液：精密称取PQQ样品适量，用稀释剂定量稀释制成每lmL中约PQQ 0.1mg的溶液。

4、检测方法

取对照品溶液与供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积按外标法计算供试品中IPQ的含量。

二、结果与讨论

1、专属性试验

取空白溶液、对照品溶液和混合溶液进样并记录色谱图，并用tPQ对照品溶液进行定位；确定出峰顺序与分离度，PQQ于IPQ之间的分离度为3.1，大于1.5，空白溶液无干扰。空白溶液图谱见图1，对照品溶液图谱见图2，混合溶液图谱见图3。

2、检测灵敏度试验

精密称取IPQ对照品适量，用稀释剂溶解并逐级定量稀释，测试IPQ峰的信噪比，确定检测限和定量限，试验结果见表1，检测限图谱见图4，定量限图谱见图5。拟定PQQ中IPQ的限度为不大于0.1％，本文综合检测限与定量限的结果选择0.05％为报告水平。
 

3、精密度试验

0.10％和0.15％水平加入IPQ，每个浓度依法平取同一对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，结果对照品溶液种主峰面积的RSD为1.4％，表明仪器精密度良好。取同一批样品，依法平行操作制备6份供试品溶液，分别测定，结果均未检出IeQ。取同一批样品，分别在0.05％、0.10％和0.15％水平加入IPQ，每个浓度依法平行操作制备3份加标溶液，分别测定，结果9份加样回收率的RSD为3.2％，表明方法重复性良好。不同分析员使用不同的仪器对同一批样品进行测定，结果一致，表明方法中间精密度良好。

4、标准曲线的绘制和线性关系的考察

配制IPQ浓度分别为0.05、0.08、0.1、0.15、0.2μg／mL的溶液，分别进样并记录色谱图，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标进行线性回归，计算线性方程和相关系数，得到线性方程为Y=77.7168X+0.042976，线性相关系数为0.99976，结果表明IPQ在线性范围内与峰面积呈良好的线性关系。

5、加样回收率试验

分别在供试品中加入规定浓度的0.05％、0.10％和0.15％水平的IPQ，依法处理并测定，计算加样回收率，结果见表2。结果表明该方法具有较好的准确度。

6、溶液稳定性试验

配制对照品溶液和供试品溶液，分别室温放置12h、24h、36h后进样检测，放置后与0h检测结果相比，对照品溶液PQQ峰面积变化均不大于4.0％，供试品溶液测定结果一致，表明溶液在36h内稳定。

7、耐用性试验

分别改变测试条件，如改变流动相中有机相的比例、流动相中缓冲溶液的pH、柱温及流速，依法测定，结果与标准条件下测定结果一致，表明本方法具有良好的耐用性。

8、样品含量测定

取PQQ样品，依法测定，结果均未检出IPQ，表明产品均符合拟定质量指标要求，具体见表3。

在方法建立过程中，考虑到IPQ杂质相对于PQQ产品的制备成本会高很多，对IPQ相对于PQQ的相对响应因子(RRF)进行了测试，结果为1.089，介于0.9～1.1之间，因此采用PQQ作为外标法计算的对照品，大大减少了IPQ杂质对照品的用量。

三、结论

方法学验证表明，建立的HPLC法测定PQQ中IPQ含量的方法，具有良好的专属性、检测灵敏度、精密度、线性和准确度，方法较为简便，准确可靠，能够比较好地控制产品质量，易于推广应用，适用于PQQ中IPQ的质量控制。

声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：磷酸氢二钾，四丁基溴化铵水，乙腈，磷酸