6、注意事项

(1)本法测定的结果为粗蛋白质的含量。如要测定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂如碱性硫酸铜、碱性乙酸铅、单宁酸溶液［p(C₇₆H₅₂0₄₆)=200g·L^-1]、三氯乙酸溶液［p(C₂HC1₃0₂)=100g·L^-1〕等处理，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质的换算系数即可得“纯蛋白质”量。其具体步骤是:称取风干磨细样品0.5× × ×g～2.2×××g，放于150 mL烧杯中，加59 mL沸水，加热至沸，5min后取下，放置30 min(如含淀粉多的样品，则勿加热至沸，而是加入50 mL沸水，再放入401～50℃水浴中保温10 min即可，然后趁热加入CuSO₄及NaOH溶液)。然后缓缓注入硫酸铜溶液〔p(CuSO₄)=60g·L^-1]25 mL，用玻棒搅拌，同时加入氢氧化钠溶液[p(NaOH)=12.5g·L^-1]25mL，放置0.5h～1 h使沉淀完全(也可放置过夜)，用倾泻法过滤，然后用沸水洗沉淀，至滤液遇BaCl₂溶液不产生白色BaSO₄沉淀为止，间接指示非蛋白质含氮物已经洗净。将已洗净的沉淀及滤器一起放入60 ^oC烘箱中烘至稍干即可。将已烘干的沉淀连带滤纸，无损地转入开氏瓶中。

样品的消煮：称取烘干样品(过0.25mm筛子)0.3g～0.5g置于50mL或100mL开氏瓶或消煮管中，加入混合催化剂1.8g，加几滴水湿润后，加5 mL浓H₂S0₄，小心轻摇后(最好加塞放置过夜)，盖上小漏斗，将消煮管放置在消煮炉或电炉上，开始时用小火加热，当消煮液呈棕色时，提高温度，消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时，再加热约10min，取下，冷却至温热时，将消煮液无损地转入100mL容量瓶中，冷却至室温后，定容并放置澄清。

氮的测定：用移液管吸取澄清待测液5.00 mL或10.00 mL放入半微量定氮仪中进行定氮(以下操作同土壤全氮的测定)。同时作空白试验，校正试剂和滴定误差，并做核对试验。

（2）称样量的大小取决于样品的含氮量。若含氮为1%～5%，称样量为0.30g，可根据含氮量的水平适当增减称样量。

（3）在消煮过程中须经常转动开氏瓶，使喷浅在瓶壁上的样品及早回流至硫酸溶液中。特别是开始消煮后不久，会有大量气泡上逸，升温不宜过快，以防溢出。

（4）核对试验是将已知量的NH₄⁺-N标准溶液〔如p（N)=100mg·L^-1NH₄⁺-N标准溶液10mL，其中含N lmg］放入半微量定氮蒸馏装置中，按测定样品同样操作步骤进行蒸馏、滴定，用以检验蒸馏过程中的误差大小。

（三）同类种子中蛋白质的测定〔染料结合(DBC法)]

1、方法原理

蛋白质中的碱性氨基酸(赖氨酸、精氛酸和组氨酸)的一NH₂、咪唑基和胍基，以及蛋白质末端自由氨基在pH2～pH3的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如桔黄G，酸性橙12^#等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质-染料络合物而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。染料结合量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。在小麦、大麦、水稻、大豆、花生等种子中，蛋白质的含量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。因此，可以用染料结合量来评比同种作物种子大量原始材料之间蛋白质含量的高低。

如果要从染料结合量来计算样品的粗蛋白质的含量，则需要用开氏法测定同类种子的一批样品的粗蛋白质，同时也用染料结合法测定其染料结合量，然后求出粗蛋白质对染料结合蛋的回归方程或绘出回归曲线。这样，测定未知样品的染料结合量，就可以从回归方程计算或查回归线得到粗蛋白质了。若只需比较蛋白质含量的高低(如在筛选同种作物种子的大批样品时)，则不必知道蛋白质的绝对含量，而只要测定样品的染料结合是即可进行比较。

该法是间接测定种子中蛋白质的方法，方法简单、快速，与开氏法的相关性较好但准确性较差，适用于大批样品的筛选工作。美国谷物化学协会将该法列为分析小麦蛋白质含量的正式方法(AACC 11-2-72)。现已有据此方法原理而设计的蛋白质分析仪。但该法对随意混合物的样品不适用。

2、主要仪器

水平振荡器;离心机;GXD-201型蛋白质分析仪或721型分光光度计。

3、试剂

染料溶液:称取柠檬酸(C₆H₈0₇. H₂O，分析纯)20.70g和磷酸氢二钠Na₂HP0₄. 12H₂0,分析纯))1.44g溶于300mL～400mL水，全部转入1000 mL容量瓶中。另外准确称取1.000g桔黄G (C₁₆H₁₀O₇S₂Na₂，分子量452.38)，加少量水在80^oC水浴上溶解。无损地转入上述容量瓶中，再加入百里酚乙醇溶液〔p(C₁₀H₁₄)=100g·L^-1]3滴～5滴以防腐，定容。此溶液为1000 mg·L^-1染料溶液。

4、操作步骤

（1）标准曲线与样品测定的同时，取1000mg·L^-1的染料溶液10mL、30mL、50mL、60mL、70mL、80mL放入100 mL容量瓶中，用水定容，即得浓度系列为100mg·L^-1、300mg·L^-1、500mg·L^-1、600mg·L^-1、700mg·L^-1、800mg·L^-1的染料标准溶液，可用GXD-201型蛋白质分析仪测透光率(T)，并用半对数座标纸绘制浓度一透光率(T)值的标准曲线，也可以把染料溶液用水稀释50倍后，用0.5cm比色槽和482nm的波长测定吸收值(A)绘制标准曲线。

（2）样品的测定称取通过0.25mm筛子的谷物样品0.2 g～0.7g(精确至0.001g),放入30mL试管中，加入1000g·L^-1染料溶液20 mL盖紧试管口，在水平振荡器上振荡60min，使样品和染料溶液充分反应，取反应后的浑浊液((8mL～10 mL即可)注入离心管中，以3000 r·min^-1的速度离心8min～12 min,至上部溶液没清为止，以下操作步骤同标准曲线。

（3）回归方程选取粗蛋白质含量从低到高(如小麦种子粗蛋白质含量可从7%～17%)的同一类谷物样品35个左右，用开氏法测其粗蛋白质，并用上述方法测定各样品的染料结合量。根据所得的结果，计算出染料结合量与蛋白质之间的回归方程。从测得的未知样品的染料结合量,求出蛋白质的含量。

5、结果计算

样品的染料结合量计算公式如下:

式中:B——每克样品所结合的染料的毫克数mg·g^-1。

V——加入染料溶液的总体积mL;

10^-3——将mL换算成L的系数;

Co——染料溶液的初始浓度，mg·g^-1；

C——染料结合反应后残余溶液中的染料浓度,mg ·g^-1;

m——样品的质量，g。

6、注意事项

（1）在偶氮磺酸染料中，除桔黄G外，也可以使用酸性12^#(Acid Orange 12^#，缩写AO₁₂,C₁₆H₁₁O₄N₂SNa，分子量 305.37)，它的分子结构与桔黄G基本相同，也含有一个偶氮发色基团，但只有一个磺酸基，即一个结合碱基的位置(桔黄G二个)，后者每个碱基结合点引起的颜色变化约是枯黄G的两倍。故其更适合于在染料结合法中应用，它们在482 nm左右有一个较宽的吸收峰，便于比色测定。

（2）样品称样量按蛋白质含量的高低而定，水稻、小麦、大麦等样品可称取0.5g，玉米称取0.7g，大豆称取0.2g，花生及鱼粉等可少一些。

（3）染料结合反应的条件，如染料的pH、样品的粒度、振荡反应的时间和温度等都会影响测定的结果，故每次测定应力求反应条件一致，特别是在测定样品与测定回归方程的样品时，反应条件尤需一致。

参考资料：土壤农业化学分析方法