（4）pH的选择

为了验证溶液pH对氨基酸检测含量的影响，移取相同量的标准储备液，调节溶液酸碱性配成不同pH(2.0～13.0)的同一理论浓度的标准溶液，进行上机检测。实验结果表明，苏氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸5种组分几乎不受pH的影响，在酸性和碱性条件下，测定含量均比较稳定；而谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸这6种组分检测含量受溶液pH的影响较大。

从图3中可以看出，谷氨酸、丝氨酸受pH影响最大，两种组分在强酸和强碱性条件下测定含量均出现了大幅增大，说明在酸碱性条件下这两种氨基酸在溶液中离子含量较中性时出现明显增大，这与其自身的分子结构、特性及解离常数有直接联系；苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸4种组分测定含量在酸性和碱性条件下波动较大，当pH小于4.0时，测定含量是中性条件下测定含量的86％～128％，而当pH大于10.0时，这4种组分测定含量波动范围是98％～127％。这些组分受pH的影响较大，主要是因为氨基酸是两性电解质，在酸性条件下，氨基(-NH2)吸收H+带正电，在碱性条件下，羧基(-COOH)可以失去H+带负电，因此在强酸和强碱溶液中氨基酸离子含量不稳定，测定含量也就随之波动。氨基酸所带的正负电荷数量相等时，即静电荷为零的两性离子状态下的pH称为氨基酸的等电点。而所测17种氨基酸的等电点在5.05～9.60之间，此时溶液中氨基酸离子含量稳定，综合考虑20种组分物化特性、等电点、解离常数等相关影响因素，我们选择pH在5.5～7.0条件下，进行定量分析。

2、方法学考察

（1）线性范围与检出限

配置20种氨基酸的混合标准工作液，并进行校准曲线拟合。通过色谱峰信噪比来计算待测组分的检出限(S／N=3)，在0.05mg／L～2.50mg／L浓度范围内，进行了6个不同浓度水平(0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.50mg／L)标准工作液的检测和线性拟合。结果(见表2)表明，20种组分线性相关系数均大于0.995，其中有15种组分相关系数大于0.999，说明在该实验条件下，20种组分同时检测时线性相关性良好。20种组分检出限在0.00107～0.06427mg／L之间，除了个别亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸外，其他17种检出限均小于0.05mg／L。

（2）回收率与精密度

分别选取葡萄、橙汁、芒果汁3种果汁饮料样品，依次向3个样品中添加浓度级别水平分别为0.20mg／L、0.50mg／L、2.00mg/L的混合标准溶液，每个浓度水平进行6次平行测定实验，来验证不同果汁基质测定时方法的回收率和精密度，根据基质浓度、添加浓度和添加后测定浓度计算回收率。表3列出三浓度水平、六次平行测定回收率和RSD数据。
 

从表3中可以看出，在0.20mg／L和0.50mg／L添加浓度水平下，精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸的回收率相对较低，回收率多数在82％～90％之间，但依然满足食品理化检验技术要求(测定含量小于O.10mg／L，回收率应在60％～120％)。20种组分三浓度水平添加回收率在82.73％～107.39％之间，RSD在1.97％～8.72％范围内，这说明20种氨基酸测定回收率好。从总体上来看，三种基质、六次平行测定回收率数据结果符合食品理化检测要求，表明方法准确性高、精密度好。

3、实际样品分析

随机抽取5种常见果汁饮料(橙汁、芒果汁、苹果汁、葡萄汁、椰子汁)，按照离子色谱仪：ICS5000+；色谱柱：AminoPacPAl0(2×250mm)，保护柱：AminoPacPAl0(2×50mm)；积分安培检测；工作电极：Gold(au)-AAA；参比电极：pH电极；电位波形：G10d，pH-Ag-AgClRE，舭A；流动相：A-NaOH溶液，B-去离子水，C-醋酸钠溶液；流速：0.25mL／min；柱温：30℃；进样量：25μL中离子色谱条件和准确取果汁待检样品0.100g，加入去离子水约150min，摇匀、静置15min，调节稀释液pH至5.5～7.0，全部转移至200mL容量瓶中，采用去离子水定容至刻度，摇匀、静置15min，取10.0mL溶液，先过0.229m水相滤膜，再过已预活化的RP柱，弃去前3mL，收集清液，待上机检测，进行了实际样品中氨基酸含量的检测分析，图4是实际样品测定离子色谱图。

从5种果汁色谱图对比来看，橙汁和葡萄汁中氨基酸的种类最多，共检出15种氨基酸，其次是苹果汁，检出14种氨基酸，而芒果汁、椰子汁中检出氨基酸仅有7种和6种；从氨基酸含量来看，检出含量较大的依次是丙氨酸、甘氨酸、精氨酸，这三种氨基酸也是果汁中主要的氨基酸。因此，建议在日常生活中多饮用橙汁、葡萄汁、苹果汁，以确保身体摄取足量的氨基酸。

三、结论

本文采用多级梯度淋洗(MGE)和积分脉冲安培检测(IPAD)相结合的方法，通过对流速、柱温、溶液pH、初始梯度浓度等多种实验影响因素的分析讨论，探索出适合20种氨基酸分离的梯度淋洗条件，建立了梯度淋洗-积分安培检测-离子色谱同时测定果汁中20种氨基酸的分析方法。实验证实，流速为0.25mL／min，柱温为30℃时，pH在5.5～7.0之间，20种组分的测定结果稳定、准确。检测方法高效快捷、灵敏准确、绿色环保，可以为果汁质量控制和营养学判定，提供一种快速定性定量方法。

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