氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的统称，是人体内许多重要生化反应的参与者，是生命延续所必须的成分。从营养学角度看，如果缺乏某种必需氨基酸，会导致生理功能异常，影响正常的抗体代谢，导致疾病产生。果汁是人们生活中常见的饮品，果汁中富含人体所需的有机酸、氨基酸等营养物质，也是人们摄取氨基酸的重要途径之一。因此，研究并建立果汁中多种氨基酸含量的检测方法，具有重要的实用价值和现实意义。

目前，氨基酸分析方法主要有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、气相质谱联用法、毛细管电泳、氨基酸分析仪法、离子色谱法等，对比分析这些方法，发现它们各有弊端，液相色谱法和氨基酸分析仪法，需要进行柱前或柱后衍生化处理，整个实验过程比较繁琐，实验误差比较大，而毛细管电泳和气相色谱法，对分析仪器或前处理条件要求比较高。

离子色谱法具有快速、准确、灵敏度高、多组分同时分析等显著的技术优势，本文采用脉冲安培一离子色谱法，在多级梯度淋洗条件下，通过研究多种实验影响因素，优化实验测定条件，建立了果汁中20种氨基酸同时测定的方法，该方法简便快捷、选择性好、灵敏度高，实现了快速分析、绿色分析、多组分同时分析的目标。

一、实验部分

1、仪器和试剂

离子色谱仪(美国ThermoFisher公司，ICS5000+)，配备电化学检测器和自动进样器(AS-AP)；高速离心机(德国Hettich公司Rotina380R)；超纯水仪(美国Millipore公司，Milli-Q)；电子天平(梅特勒公司ML802／02)；20种氨基酸标准品(＞98.0％，上海安谱科学仪器有限公司)；氢氧化钠溶液(50％w／w，FisherChemical)；醋酸钠(＞99.9％，ThermoScientific)；盐酸(优级纯)。

2、离子色谱条件

离子色谱仪：ICS5000+；色谱柱：AminoPacPAl0(2×250mm)，保护柱：AminoPacPAl0(2×50mm)；积分安培检测；工作电极：Gold(au)-AAA；参比电极：pH电极；电位波形：G10d，pH-Ag-AgClRE，舭A；流动相：A-NaOH溶液，B-去离子水，C-醋酸钠溶液；流速：0.25mL／min；柱温：30℃；进样量：25μL。

3、前处理方法

准确取果汁待检样品0.100g，加入去离子水约150mE，摇匀、静置15min，调节稀释液pH至5.5～7.0，全部转移至200mL容量瓶中，采用去离子水定容至刻度，摇匀、静置15min，取10.0mL溶液，先过0.22μm水相滤膜，再过已预活化的RP柱，弃去前3mL，收集清液，待上机检测。

二、结果与讨论

1、试验条件的选择

（1）流速的选择

依次考察了0.20、0.25、0.275、0.30mL／min四个流速条件下的组分分离状况。结果表明，0.20mL／min时系统压力较小，峰宽较大，峰灵敏度下降，整体分离度不高；0.30mL／min时系统初始压力高达19.2MPa，35min时系统压力超过上限20.7MPa；O.25和0.275mL／min流速时，26种组分灵敏度和分离度均很理想，但0.275mL/min时最高压力为19.6MPa，接近系统压力上限，压力过大易导致色谱柱塌陷或者系统漏液，影响整个检测系统运行的（2）梯度淋洗条件的选择一般淋洗梯度条件难以实现20种氨基酸组分的有效分离，为提高检测灵敏度和色谱峰分离度，先后根据不同淋洗时间段、不同淋洗浓度、不同淋洗斜率进行了30多次实验研究分析，最终根据分离效果和基线稳定性选取了表1中多级梯度淋洗条件。从表1中可以看出，色谱分离淋洗时间被分成5段(0～12min、12～16min、16～24min、24～40min、40～50min)，初始淋洗浓度是整个多级梯度淋洗条件的基础，因此在0～12min采用的是50mmol／L氢氧化钠淋洗液，恰好能够实现前10种弱保留组分有效分离。在12～16min时间段，选择斜率为7.00mmol／(L·min)浓度氢氧化钠淋洗液梯度，可确保组分11至组分13有效分离；在16～24min时间段，开始使用较强淋洗溶液醋酸钠溶液，为中强保留组分洗脱和分离做好准备。在24～40min时间段，选取氢氧化钠溶液、醋酸钠溶液、去离子水配比(24:40:36)的梯度淋洗溶液进行洗脱，确保了组分14～19的有效分离。在40～50min时间段中，为使强保留组分色氨酸快速洗脱，选择了氢氧化钠溶液、醋酸钠溶液配比(50：50)浓度的洗脱液，图1是20种氨基酸混合标准溶液离子色谱图。

Peaks：1.精氨酸(Arginine)；2.赖氨酸(Lysine)；3.谷氨酰胺(Glutamine)；4.天冬酰胺(Asparagine)；5.丙氨酸(Alanine)；6.苏氨酸(Threonine)；7.甘氨酸(Glycine)；8.缬氨酸(Valine)；9.丝氨酸(Serine)；10.脯氨酸(Proline)l11.异亮氨酸(Isoleucine)；12.亮氨酸(Leucine)；13.蛋氨酸(Methionine)I14.组氨酸(Histidine)；15.苯丙氨酸(Phenylalanine)；16.谷氨酸(Glutamicacid)；17.天冬氨酸(Asparticacid)；18.半胱氨酸(Cysteine)；19.酪氨酸(Tyrosine)；20.色氨酸(Tryptophan)。

（3）柱温的选择

温度能够影响到色谱柱的柱效、选择性、检测灵敏度和稳定性。柱温改变，直接影响分离效果和分析速率。柱温升高，会在一定程度上提高色谱柱内离子交换速率，有利于提高柱效，缩短分析时间，但降低了分离选择性，不利于组分之间的分离。从提高分析速率角度考虑，一般会选择较高的柱温，而从提高分离度角度考虑，应该选用较低的柱温。本文先后考察了25℃、30℃、35℃色谱柱温条件下多种氨基酸分离状况。从图2中可以看出，25℃时，色谱柱温较低，系统压力较大，组分9丝氨酸和组分10脯氨酸，重叠在一起(图中标记为9号)，没有实现分离。当色谱柱温为35℃时，柱温升高，离子交换速率增大，柱效得到提高，系统压力降低至14.2MPa，缩短了分析时间，但降低了柱选择性，特别是组分13亮氨酸和组分14蛋氨酸的分离度明显减小，无法确保定量准确性。在30℃柱温条件下，系统压力是15.5MPa，压力大小适中，分析速率适宜，分离度满足检测要求，氨基酸组分的总体分离效果较好，因此，我们选择在30℃条件下进行实验分析。
 

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