2.2 EGCG稳定性的改变对NCM460细胞的胞内、外H₂0₂浓度影响

2.2.1 细胞内H₂0₂水平的检测

对比不同处理时间点发现，胞内H₂0₂浓度呈现先上升后下降的趋势；与对照组0μmol/L相比，H₂0₂浓度lh内出现了短暂增高，其中80μmol/L组极显著增高(P＜0.001)(图6a)，处理3h后，与对照组相比高浓度EGCG中的H₂0₂浓度出现显著下降(P＜0.05)(图6c)，这种现象在处理12h后更显著(P＜0.001)(图6d)。

2.2.2 胞外H₂0₂水平的检测

结果显示，随着处理时间的延长，培养体系中H₂0₂浓度呈现上升趋势；对比相同时间不同浓度组发现，处理2、3、6、12h后，20、40、80μmol/L的处理体系H₂0₂浓度显著高于对照组(P＜0.05)，即培养体系巾的H₂0₂浓度随时问延长和EGCG浓度的增加而显著上升，处理24h后胞外的H₂0₂水平出现明显降低，见图7。

3 讨论

EGCG的多种生物活性已在细胞培养模型中得到证实，其中最显著的为抗氧化、抗炎和抗癌作用，这表明EGCG很可能成为因ROS增加和/或细胞抗氧化能力不足引发的退行性疾病的临床药物。然而，EGCG在相应动物实验中的结果是存在争议的。依据EGCG结构特征，其在细胞培养物中和整个生物体中的活性不一致可能归因于EGCG分子的稳定性不足，EGCG不受控的降解或聚合，不仅会导致体外研究结论不准确，还会限制EGCG在体内的生物利用度。

本实验发现不同的溶液环境对EGCG的氧化聚合有较明显影响，在DMEM培养液中EGCG的聚合效率更高，而H2O的影响较小，这与Krupkova等的研究结果吻合；高温促进了EGCG的自动氧化，Krupkova等也证实低温可以保持EGCG的稳定性；不同EGCG浓度下EGCG的氧化聚合程度不同，高浓度促进EGCG的聚合，同时，随着反应时问的增长，EGCG的聚合物增多；溶液pH对EGCG的稳定性也有较明显影响，EGCG在酸性环境中更加稳定(pH＜6)，这与相关研究相符。由此可见，溶液环境、温度、反应时问、EGCG浓度和溶液pH等因素均会影响EGCG的稳定性，在相关实验条件下应给予考虑。已有研究证实，环境是确定EGCG抗淀粉样蛋白功效的关键因素，因此，解析EGCG稳定性的环境条件对于进一步研究其在机体中发挥功效的机制有重要意义。

在正常培养细胞体系巾探讨了EGCG的稳定性对其抗氧化能力的影响，发现胞外H₂0₂水平在时间和浓度效应上与对照组相比呈上升趋势，而胞内出现先上升后下降的趋势。研究分析，EGCG在培养体系中会发现氧化聚合反应，生成H₂0₂；随后，H₂0₂进入细胞，使胞内H₂0₂水平迅速上升，给细胞造成氧化胁迫，激活胞内的抗氧化系统应对胁迫，随着抗氧化酶系的积极响应，胞内H₂0₂水平出现短暂上升然后开始下降，最终表现为EGCG处理后，细胞内H₂0₂浓度低于未处理细胞，表现为抗氧化效应，特别是20μmol/L组，这一过程可能是EGCG发挥生物活性，特别是在抗增殖和癌症治疗中的潜在作用。如20μmol/L的EGCG是其通过预警响应发挥抗氧化活性的最适浓度，随着EGCG浓度的升高，氧化聚合反应产生的H₂0₂水平超过细胞氧化应激范围，可能对细胞造成氧化损伤，详细分子机制有待进一步验证。

4 结论

RPMI1640和DMEM培养基较H₂0₂更促进EGCG的氧化聚合，低温低EGCG浓度及酸性条件利于EGCG的稳定，同时EGCG的氧化聚合随反应时间延长而加剧。存含有细胞的培养体系中，EGCG也会发生自动氧化聚合并产生H₂0₂，导致细胞内外的H₂0₂浓度升高，但胞内H₂0₂浓度呈现先上升后下降的趋势。研究结果提示，一定浓度的EGCG在培养细胞中可能通过氧化聚合产生H₂0₂，形成氧化胁迫，进而激活细胞内抗氧化防御系统，使细胞内H₂0₂浓度随后降低，表现出抗氧化效应。

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