阿魏酸酯酶是一种能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键。使阿魏酸游离出来的羧酸酯酶，在食品和饲料等工业中有着光明的前景。食品工业利用阿魏酸酯酶降解植物细胞壁中阿魏酸酯键，得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。通过阿魏酸酯酶的处理。饲料工业中植物性原材料的细胞壁变的疏松，更容易被禽畜消化利用。研究表明，真菌和细菌都能分泌阿魏酸酯酶嘲，然而目前研究较多的是真菌中的黑曲霉。

黑曲霉在工业中有广泛的应用。如在柠檬酸生产以及各种高价值酶产品包括果胶酶、蛋白酶、淀粉葡糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶和脂肪酶等的生产。虽然曲霉菌是一种重要的工业微生物，但这些丝状微生物中有一个难以控制的特性就是它复杂的形态，它们不仅有致密的小球还有黏性的菌丝网。由于以分散菌丝形态存在的真菌可以带来更高的产品收益率。因此其价值一般优于菌丝形成小球形态的真菌。合适的菌株形态对发酵的重大作用促使研究者尝试改变真菌的生长特性，相关研究包括一些培养参数的改变，如接种量、转速、培养基配料以及酸碱度。已有研究通过对具有合适形态突变体的随机筛选得到了较理想的菌团形态，并改善了半纤维素酶的产量。因而，改善真菌形态已经成为生物技术的一个研究热点。最近发现通过向培养基中添加滑石粉和氧化铝可以控制真菌的形态，其对黑曲霉和其它丝状微生物的形态发展具有强烈的影响。本文通过向黑曲霉ZJUQH液体深层发酵培养基中添加不同质量浓度的滑石粉、氧化铝和高岭土，探究添加微颗粒对黑曲霉菌丝生长和产阿魏酸酯酶酶活的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基配方

1)菌株

黑曲霉ZJUQH，由本实验室保藏。

2)斜面培养基

20％马铃薯煮出液，1％葡萄糖。

3)基础发酵培养基(质量分数)

2.6％豆粕浸出液、1.035％蛋白胨、0.3％KH₂P0₄、0.8％Na₂HP0₄·7H₂0、0.01％NaC1、0.02％MgS0₄·7H₂0、0.005％CaCl₂，自然pH值。

1.2 主要材料与试剂

滑石粉颗粒(800目)，上海麦克林生化科技有限公司；三氧化二铝颗粒(200～300目)、高岭土颗粒(300目)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；马铃薯，购于超市；豆粕、蛋白胨，生工生物工程股份有限公司；KH₂P0₄、Na₂HP0₄·7H₂0、NaCl、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂，国药集团化学试剂有限公司；阿魏酸甲酯，南通飞宇生物科技有限公司；二甲基甲酰胺、色谱纯级乙腈、甲酸、甲醇，天津四友精细化学品有限公司。

1.3 主要仪器与设备

LC-2010AHT高效液相色谱仪，日本岛津公司；Beckman冷冻高速离心机，美国Beckman公司；L500台式低速大容量离心机，湖南湘仪有限公司；DCQF-1超声复频清洗器，上海东大超声仪器有限公司；HYG-Ⅱa恒温调速摇床，上海欣蕊自动化设备有限公司：Stemi2000-C立体显微镜，德国ZEISS公司；XL-30ESEM扫描电镜，荷兰Philips公司；HitachiS-3000N扫描电镜，日本Hi-tachi公司；Mastersizer2000激光粒度仪，英国MalvemInstmments公司。

1.4 发酵培养及酶液制备

将微颗粒的质量浓度分别设为0.1，0.5，1，5，10，20g/L，即在30mL的培养基中分别加入0.003，0.015，0.03，0.15，0.3，0.6，3g的微颗粒。微颗粒与液体培养基分开灭菌，备用。

菌株接种到配好的PDA培养基上，放入28℃恒温生化培养箱中培养6d后制成孢子悬浮液，按一定接种量(孢子数约107CFU/mL)接种于装有30mL液体培养基的250mL三角瓶中，置于28℃，180r/min的旋转式摇床中培养7d。分别于3，5，7d取样。将菌悬液置于低速离心机中3000r/min离心30min，取上清液即为粗酶液于4℃冰箱中保存，待用。

1.5 酶活测定

1.5.1 阿魏酸酯酶酶活测定

用一级色谱纯甲醇溶解阿魏酸甲酯配制成50mmol/L的阿魏酸甲酯溶液，再用柠檬酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH6.0)稀释10倍。取2mL稀释后的阿魏酸甲酯溶液重新加热至40℃，加入1mL稀释10倍的粗酶液。混匀。混合物于40℃反应30min后加热至100℃，10min后终止反应。反应混合物于室温冷却，以蒸馏水代替底物溶液体系为空白对照。

酶解反应后的阿魏酸产物参考文献的HPLC法定量分析，并稍作修改。高效液相色谱条件：流动相为乙腈-0.5％甲酸混合液(V_乙腈：V_0.5％甲酸=30:70)，C18反相柱(250mm×4.6mm，4μm)，检测温度30℃，进样量10μL，检测波长317nm。阿魏酸酯酶的酶活定义为在40℃，pH6.0条件下，每分钟水解底物阿魏酸甲酯产生1μmol阿魏酸所需要的酶量为1个酶活力单位。

1.5.2 阿魏酸标准曲线测定

取阿魏酸标准制品配成1mg/mL的标准溶液，依次稀释成100，50，10，8，4，2，1mg/L标准溶液，按1.5.1节中的色谱条件进行HPLC测定，记录峰面积，以峰面积对标准质量浓度绘制标准曲线。

1.6 蛋白质质量浓度的测定

采用Bradford的蛋白质定量试剂盒法检测发酵上清液的蛋白质质量浓度。取考马斯亮蓝染液平衡至室温混匀，预热分光光度计。将0，1，2，3，4，5，6μL牛血清蛋白(BSA)标准溶液(1mg/mL)分别加入酶标板，加PBS补足到10μL；加Bradfbrd考马斯亮蓝染液190μL后混匀，室温放置5-10min，酶标仪测定波长595nm处的吸光度值，以不含BSA的样品吸光度值作为空白对照，以蛋白质质量浓度(g/L)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。在样品测定中，取10μL发酵液样品和190μL考马斯亮蓝染液混匀，室温放置5～10min，酶标仪测定波长595nm处的吸光度值。随后根据标准曲线计算出样品中所含的蛋白质质量浓度，用于阿魏酸酯酶比活力的计算。

1.7 生物量的测定

将各菌株的发酵液置于离心杯中，于3000r/min离心30min，收集菌丝沉淀，用与发酵液体积相等的蒸馏水洗涤并离心，重复3次，最后将所得菌丝体于60℃烘干至恒重。对应减去微颗粒的质量，即得生物量。

1.8 显微镜观察及粒度分布

1)菌体微观形态观察

用立体显微镜观察菌团，然后通过预处理，用XL-30ESEM扫描电镜对菌团进行更细致的观察。

2)菌体粒度分析

用HitachiS-3000N扫描电镜在20kV下观察微颗粒，然后用Mastersizer2000激光粒度仪测定样品的粒度分布。

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