有机砷制剂是畜禽生产中广泛应用的饲料添加剂，其种类主要有洛克沙胂、阿散酸、硝苯砷酸等，具有抗菌、抗球虫、促进蛋白质合成、提高饲料利用率、改善产品外观等作用。长期、大量使用有机砷制剂可导致过量的砷蓄积在畜禽体内，造成器官组织功能紊乱和器质性病变，表现为中枢或外周神经系统失调，视神经萎缩，甚至失明。另外，有机砷不易被机体吸收，大部分以原形随排泄物进入生态环境，污染水体和土壤，通过食物链的蓄积可对人类健康造成巨大影响。欧盟和美国早已宣布禁止洛克沙胂和阿散酸的使用，我国农业部第2638号公告规定，自2019年5月1日起，禁止使用洛克沙胂、阿散酸的原料药及各种制剂。为了确保饲料及动物性食品安全，维护公共卫生和生态安全，建立饲料中有机砷的检测方法以监控其非法添加势在必行。

迄今为止，国内外对有机砷制剂的检测主要采用气相色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法，而采用液相色谱-串联质谱法检测有机砷制剂的报道很少，未见关于高效液相色谱串联质谱法同时检测饲料中3种有机砷制剂的报道。本研究探讨建立采用高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙胂的方法。

一、材料与方法

（一）仪器与材料

1. 仪器。

超高效液相色谱-串联质谱仪（QTRAP 4500型，AB Sciex公司，美国）；电子天平（0.01mg,METTLER公司，瑞士）；旋转蒸发仪（Heidolph公司，德国）；高速离心机（Sigma公司，德国）；涡旋混合仪（IKA公司，德国）。

2. 试剂与药品。

甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，J.T.Baker公司）；水为超纯水；10%甲醇水溶液；1%甲酸水-乙腈溶液（25∶75,V∶V）：取1.0m L甲酸加入到99 m L 75%乙腈水溶液中；洛克沙胂（含量99.0%）、阿散酸（含量99.0%）和硝苯砷酸（含量99.0%）标准品（Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司，德国）。

（二）实验方法

1. 标准溶液配制。

精密称取3种有机砷制剂对照品各10 mg，置于3个100 m L容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得终浓度为100μg/m L的标准储备液，置于-20℃冰箱中保存6个月，临用前用10%甲醇水溶液稀释成所需浓度的标准工作溶液。

2. 样品处理。

称取饲料样品2.00（±0.02) g于50 m L离心管中，加入10 m L 1%甲酸水-乙腈（25∶75,V∶V）超声提取10 min，中间手动振摇2次，10 000 r/min离心10 min，将上清液转移至旋转蒸发瓶中，重复提取1次，合并上清液，在40℃下旋转蒸发浓缩至<3 m L，用10%甲醇水溶液定容至5 m L,6 000 r/min离心10 min，上清液过0.22μm滤膜后，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

3. 色谱条件。

色谱柱为phenomenex Kinetex^RF5色谱柱（3.0 mm×50 mm,2.6μm，美国Phenomenex公司）；流动相A为0.1%甲酸乙腈，流动相B为0.1%甲酸水；流速为0.4 m L/min；进样量为5μL；柱温40℃。流动相梯度洗脱程序见表1。

4．质谱条件。

电喷雾离子源；扫描方式为正、负离子同时扫描(ESI±）；检测方式为多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）为5 500 V；雾化气压力（GS1）为50 psi；气帘气压力（CUR）为30 psi；辅助气流速（GS2）为60 psi；离子源温度500℃；碰撞气（CAD),Medium。离子参数见表2。

二、结果与分析

（一）标准曲线与线性范围

精密量取3种有机砷制剂标准工作液适量，添加到空白样品中，制得阿散酸和洛克沙胂浓度为5.0、10、20、50、100、200μg/kg的各系列空白添加试料；制得硝苯砷酸浓度为50、100、200、500、1000、2000μg/kg的各系列空白添加试料，样品处理后，上机测定。以特征离子质量色谱峰面积y为纵坐标，各系列空白添加的浓度X为横坐标，绘制标准曲线（见表3）。

（二）检出限与定量限

用空白饲料样品进行添加试验，以3倍信噪比（S/N≥3）测得洛克沙胂、阿散酸的检出限为5.0μg/kg，硝苯砷酸的检出限为50.0μg/kg；以10倍信噪比（S/N≥10）测得阿散酸、洛克沙胂的定量限为10.0μg/kg，硝苯砷酸的定量限为100.0μg/kg。空白饲料添加洛克沙胂、阿散酸、硝苯砷酸标准溶液特征离子质量色谱图如图1所示。

（三）准确度与精密度

空白饲料样品中添加标准工作溶液，阿散酸和洛克沙胂添加浓度为10、20、40μg/kg，硝苯砷酸的添加浓度为100、200、400μg/kg，每个浓度做6个平行样品，重复3次，按照样品处理方法制备样品溶液，回收率及精密度见表4和表5。

三、讨论

（一）提取溶剂的选择

有机砷制剂易溶于甲醇、乙醇、乙腈和热水中，参考相关文献资料，分别比较了甲醇和水、乙腈和水、磷酸氢二钾作为提取溶液时的提取效率，结果表明，提取液中含有大比例水相时回收率只有20%～30%，提取液中含有大比例有机相时回收率明显升高，而且大比例的乙腈能使样品中的蛋白质变性沉淀，可减少杂质干扰。比较不同比例的乙腈-水（50∶50、75∶25、90∶10,V∶V），以乙腈-水（75∶25,V∶V）提取回收率最高，而加入0.1%甲酸、0.5%甲酸、1%甲酸、2%甲酸，经过上机检测，采用1%甲酸水-乙腈（25∶75,V∶V）时，回收率达到60%～80%，色谱图良好。

（二）提取方法的选择

常见的饲料中药物提取方法有振荡、涡旋和超声法，前两者通常需要较长的时间，本实验选择超声处理，将提取程序所需时间缩短到10 min，且能得到满意的回收率。

（三）分离条件的优化

通过调节流动相的组成、梯度、p H值、选择适宜的色谱柱来获得最佳的色谱分离条件。选用waters BEH C₁₈柱时，各化合物不能达到基线分离，本研究选用phenomenex Kinetex^R F5色谱柱，各目标化合物的分离度良好；在流动相中加入0.1%甲酸获得了更加稳定和对称的峰形。

四、结论

本试验建立了同时检测饲料中洛克沙胂、阿散酸和硝苯砷酸的高效液相色谱-串联质谱法，操作简单，色谱条件易掌握且重复性好。洛克沙胂和阿散酸的平均加标回收率在62.7%～81.7%,RSD≤15%；硝苯砷酸的平均加标回收率为72.5%～83.3%,RSD≤15%，方法的准确度、精密度和灵敏度都能满足分析要求，对测定饲料中的有机砷制剂有很好的适用性。

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