5、测定和计算

（1）将待测样10μL注入色谱仪，根据其峰高或峰面积设定有关最佳参数如最小峰面积；

（2）注入有机酸标准系列溶液10μL进行色谱分析；

（3）以各标准溶液的保留时间定性；

（4）根据有机酸标准系列溶液各响应值(峰高或峰面积)作一响应值与浓度的标准曲线；

（5）分别注入待测样10μL，进行色谱分析；

（6）根据各待测样的响应值，在标准曲线上查出其相应的含量。

若高效液相色谱仪配有微处理机，则不必配制系列标准溶液，只要选择与待侧分析样品浓度相近的(土10%以内)标准溶液注入色谱仪，仍以保留时间定性，根据标准样品的响应值由计算机计算出校正因子，再由计算机用比例计算法作定量计算。

七、有机酸组分的测定（气相色谱法）

1、方法原理

在硫酸的催化下，使有机酸成为丁酸的衍生物，用气相色谱法分别定量，可定量的有机酸有:甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、乳酸、异戊酸、异乙酸、正己酸、乙酰丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、反丙烯三羟酸以及柠檬酸等。

2、主要仪器

气相色谱仪：装有复火焰离子检测器、程序升温装置和自动记录器；柱：填充100g·Kg^-1Silicone DC560，Diasolid L (60目～80目)的φ3mm×2m玻璃柱或不锈钢柱；电热板：功率50 W；试样前处理用柱：φ10mm×70mm玻璃柱2根；具塞试管：φ25mm×100mm。旋转式蒸发器；滑线变压器；玻瑞器皿：20 mL容量瓶，滴定管，安全移液管，冷凝管。

3、试剂

（1）离子交换树脂:使用Amberlite (一种人工合成的酚甲醛离子交换树脂)CG120、Amberlite CG4B(或Amberlite IRA410)；

（2）将上述有机酸分别配成已知浓度的标准有机酸，分析时需要的酸的最小含量，因酸的种类不同而异:甲酸、乙酸等低分子酸为1mg左右；苹果酸、柠檬酸等为几毫克；酒石酸如少于10mg便不能获得高精度的分析结果；

（3）乙醇溶液〔ψCH₃CH₂OH)=80%]:800mL无水乙醇(CH₃CH₂OH，分析纯)用水稀释至1L；

（4）氢氧化钠溶液〔c(NaOH)=0.1mol·L^-1]: 4g氢氧化钠(NaOH，分析纯)溶于水稀释至1L；

4、操作步骤

（1）试样准备

蔬菜:把试样切成3mm见方，称取25.0g加温水(80^oC，部分蔬菜可用80%乙醇代替，研磨，提取2次，合并提取液，加酚酞指示剂，用氢氧化钠溶液[c(NaOH)=0.1 mol·L^-1〕滴定，使有机酸成为钠盐。中和后的溶液，在40℃下用旋转蒸发器浓缩至约15mL,浓缩液移入25mL容量瓶并定容。必要时可过滤除去不溶物。

吸取此提取液10mL，用AmberliteCG120,Amberlite CG4B处理，得到有机酸组分，将其醋化，供气相色谱分析用。

水果:从新鲜水果试样中称取20.0g，加3倍量的80%乙醇研磨，经离心分离后，收集上清液，残渣再反复提取2次，合并提取液，加酚酞指示剂，用氢氧化钠溶液[c(NaOH)=0.1 mol·L^-1〕中和。中和后在80℃恒温水槽中加热10min后，定容至200 mL，使用前保存于冰箱中。

取此提取液10mL～50mL，用旋转蒸发器浓缩至无醇后，依次通过AmberiteCG120,CG4B及CG120柱，得到有机酸组分，加入酚酞指示剂并用氢氧化钠溶液滴定，然后保存于约40℃下，用旋转热发器浓缩，干涸后进行丁酯化处理。

（2）酯化：用上述方法制备的有机酸中，加丁醇2mL，无水硫酸钠2g，浓硫酸0. 2 mL，连接冷凝管，在电热板上平稳沸腾约30min(加热时要不断搅拌)，使有机酸成为丁酯。

（3）酯的提取：酯化终了，加水和己烷各5mL，充分混合，使酯转溶于己烷中，每次用己烷5mL提取3次。用移液管移入20 mL容量瓶中，容量瓶中事先巳装有5g·L^-1十九烷(内标)的己烷溶液1 mL，用己烷定容。再加无水碳酸钠0.5g，去除混入的微量硫酸。取5μL进行气相色谱分析。

（4）分析：柱子在60℃下保持6 min后，以每分钟升温5℃的速度升至250^oC。氮气、氢气、空气的流量分别为60 mL/min、50 mL/min、900 mL/min,注入口及检测器的温度为260℃。灵敏度为10mL，范围为0.01V。

（5）工作曲线的制备：将已知浓度的标准有机酸用上述方法制成丁酯后，用气相色谱仪分析，制成标准曲线。

5、注意事项

（1）蔬菜中的有机酸，50%～90%以结合酸的形式存在，用80%乙醇提取比用温水的提取率低。

（2）其中所含总有机酸换算成柠檬酸要在100mg以下。分析蔬菜时以吸取10mL～20mL为宜。

（3）薯类若用温水提取试样，用离子交换树脂处理时则需要较长的时间，所以这里用80%乙醇提取，溜去乙醇后，再进行离子交换树脂处理。

（4）大部分蔬菜试样有时混入一些丁醇不溶物或酯化反应液呈浅褐色，但对测定值没有影响。

（5）对于含结合酸多的水果，用温水提取的提取率高。但果胶等混入，粘度将增大，往往会使以后的处理费事，故乙醇的浓度应选择适当。

（6）其中所含的总有机酸换算成柠檬酸要在100mg以下，水果以相当于新鲜物重1 g～10g的试样为宜。

（7）浓缩使用旋转蒸发器即可，如能进行冷冻干燥则更好。

（8）使用油浴也可，使用电热板从试管底部加热方便。沸腾剧烈时用滑线变压器调节。

参考资料：土壤农业化学分析方法