肉食品中伤害最大的细菌是瘦脸针梭状枯草芽孢菌通称肉毒梭菌，该菌在厌氧发酵环镜中可造成肉毒毒素，肉毒毒素毒副作用比氰化钾强一万倍。因为肉毒梭菌造成的肉毒毒素的有毒毒副作用，世界各地都容许肉毒梭菌缓聚剂一亚硝酸钠做为食用添加剂在肉类食品中限定应用。亚硝酸钠在肉类食品中能够显著抑止瘦脸针梭状枯草芽孢菌造成内毒素。可是近几十年来，亚硝酸钠已变成食品卫生安全异议的聚焦点。由于在一定情况下（例如高溫），肉食品中残存的亚硝酸钠能够 与分散碳水化合物和丙烯胺反映，转化成痕量元素N-亚硝酸。小动物及临床流行病学科学研究结果显示N-亚硝酸是强致癌物质。

次磷酸钠能够 控制革兰氏阳性绿脓杆菌（包含肉毒梭菌），可以处理肉食品产品质量难点，而且中国次磷酸钠生产工艺及水准持续提升 ，具有了生产制造食品级不锈钢次磷酸钠的工作能力，现阶段早已到系統的、全方位的科学研究次磷酸钠取代亚硝酸钠的机会。次磷酸钠是一种比较理想的工业级氧化剂，关键用以化学镀镍、电镀工艺、有机化学工业生产、食品工业和冷藏、橡胶制品增稠剂。对于次磷酸钠的杀菌作用，海外科研工作人员己经開始科学研究次磷酸钠抑止肉毒梭菌的实际效果，尝试做为亚硝酸钠抗菌剂的替代品，获得不错进度。Rhodehamel等觉得次磷酸钠口感上很柔和，无刺激性味，对肉类食品的顏色和抗氧化层面没什么副作用，此外，次磷酸钠是不确定性的一种好的抗菌剂，而且在1990年被审批为安全性化学物质（GRAS）。Woodetal和PeggandShahidi试验说明，次磷酸钠添加到肉浆中，针对肉毒菌素的抑止是合理的。

本科学研究用不一样含量的次磷酸钠（下称SHP）水溶液对肉食品中常用的六种有危害菌（生孢梭菌、胀气荚膜梭、菌沙门菌、大肠埃希菌、橙黄色链球菌、蜡样枯草芽孢菌）开展抗菌解决，根据对照实验与对照组抑菌圈尺寸比照，分辨SHP对六种菌的抗菌实际效果；并且以有抗菌实际效果的菌苗为研究对象，探寻SHP的最少抗菌浓度值；进一步探索SHP抑止肉毒梭菌的最好抗菌标准。

依据《病原微生物实验室生物安全管理条例》归类标准，瘦脸针梭状枯草芽孢菌归属于试验室二级毒副作用菌，为高致病微生物，对科学研究工作人员的生命安全有一定威协，不宜试验室工作人员立即科学研究，因为生孢梭菌的危险较小，而且其特性特点与肉毒梭菌极为类似，因此 许多专家教授用生孢梭菌替代肉毒梭菌开展科学研究。因而，本毕业论文全部实验均以肉毒梭菌的科学研究取代菌生孢梭菌来进行科学研究。

一、原材料与方式

1、原材料与实验试剂

次磷酸钠（SHP）：纯净度≥99.8％，阿拉丁有限责任公司；生孢梭菌CICC（10385）干冻粉、胀气荚膜梭菌CICC（22949）干冻粉、蜡样枯草芽孢菌CMCC（B）63301干冻粉；

大肠埃希菌0157（EPEC）、沙门菌（阿贡纳）、橙黄色链球菌ATCC（6538）、纯净水、液体石蜡、厌氧发酵带；

加强梭菌培养液、PCA、LB骨头汤培养液、加强梭菌琼脂粉；

碳酸钠AR。

2、仪器设备与机器设备

超净工作台、恒温箱、电冰箱、厌氧罐、光度计。

3、实验方法

（1）SHP梯度方向液的配置

抗菌实际效果试验SHP水溶液配置：

取七个500mL容量瓶清洗杀菌，各自型号1～7。各自配置0mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L规范SHP水溶液，混匀。取7支整洁已杀菌试管婴儿在无菌车间中每一个试管婴儿各自放入不一样含量的SHP水溶液10mL，型号，橡胶塞杀菌塞紧，预留，切勿将水溶液先装进试管婴儿随后变道杀菌。最少抗菌浓度值探寻SHP水溶液配置：

跟上面一样解决方式各自配置0mg/L、2000mg/L、2200mg/L、2400mg/L、2600mg/L、2800mg/L、3000mg/L规范SHP水溶液。

（2）培养液的配置

加强梭菌培养液：称量本产品38.0g，加温拌和融解于1000mL纯净水中，散装多个试管婴儿中10mL，滴进适当液体石蜡封闭式液位，变道后121℃高压灭菌15min，预留。

LB骨头汤培养液、PCA、加强梭菌琼脂粉：按表明称量相对应本产品，加温拌和融解于1000mL纯净水中，散装10个三角瓶中，121℃高压灭菌15min，预留。

（3）菌种活化与菌液配置

生孢梭菌、胀气荚膜梭菌：超净工作台中，用烧红制冷的接种环将菌苗连接加强梭菌培养液试管婴儿中活性24h；依照GB测菌落总数，将原菌液适度稀释液操纵菌液浓度值大约在105上下。

沙门菌、大肠埃希菌、橙黄色链球菌、蜡样枯草芽孢菌：超净工作台选用烧红制冷的接种环将菌苗连接装有10mLLB的三角瓶中活性24h；依照GB测菌落总数（大约在2.37×108），将原菌液适度稀释液操纵菌液浓度值大约在106上下。

（4）抑菌圈的测量

生孢梭菌、胀气荚膜梭菌抑菌圈的测量：

杀菌夹层玻璃培养皿底端区划地区并序号1～7→倒平板每一个培养皿20mL→每一个平板电脑加100μL菌液施胶匀称一每一个地区中间放上一个杀菌的牛津杯一每一个牛津杯里添加200μL相匹配序号的SHP水溶液一盖好外盖后放进厌氧罐中并放进厌氧发酵带一封好厌氧罐外盖移进恒温箱。做多个平行面试验，36℃下塑造24h，精确测量抑菌圈。

大肠埃希菌、沙门菌、橙黄色链球菌、蜡样枯草芽孢菌抑菌圈的测量：杀菌夹层玻璃培养皿底端区划地区序号1～7→移液器汲取1mL菌液各自进入到培养皿中→加温溶化PCA制冷至40～50℃倒平板→每一个地区中间放上一个杀菌的牛津杯→每一个牛津杯里用移液器添加200μL相匹配序号的SHP水溶液→盖好外盖移进恒温箱。做多个平行面试验，36℃下塑造24h，精确测量抑菌圈。

（5）SHP对肉毒梭菌、胀气荚膜梭菌最少抗菌浓度值的测量

活性后原菌液混匀→散装到7支试管婴儿中每一个100μL一各自添加1～花了7天时间SHP水溶液lOmL→混匀滴进适当液体石蜡封闭式，36℃下塑造24h→取7支杀菌整洁比色皿→各自添加1～花了7天时间菌液（混匀）→600nm下测其OD值明确MIC。

（6）生孢梭菌的最好抑止标准测量

SHP对身孢梭菌抑止关键受溫度、時间、pH要素的危害，挑选L9（34）正交实验，方案设计如下所示。

取9个杀菌整洁夹层玻璃培养皿各自序号1～9→倒平板每一个培养皿20mL→用移液器每一个平板电脑加IOOμL菌液于培养液表层涂抹匀称→每一个培养皿里放上三个杀菌的牛津杯→每一个牛津杯里添加相对应pH的SHP水溶液200μL盖好外盖→放进厌氧罐中开启厌氧发酵袋封住外盖→同一塑造溫度的对照组移进相匹配的恒温箱→精确测量各对照组抑菌圈直徑尺寸，照相，纪录，数据分析。对检测結果开展数据分析，找到最好组成，进而明确SHP对身孢梭菌的最好抑止标准。

（7）数据信息数据分析

每一组试验反复3次测量，选用SPSSl9.0统计分析软件对信息完成数据分析及显著性分析，数据信息选用标准偏差表明。

二、結果与探讨

1、SHP对肉食品中的普遍有危害菌的抗菌实际效果

本分析挑选肉食品中常用的伤害菌，包含革兰氏阳性菌、胀气荚膜梭菌、肉毒梭菌、橙黄色链球菌、蜡样枯草芽孢菌；革兰氏阳性菌阴性菌：沙门菌、肠子埃希氏菌，科学研究次磷酸钠对每一种病菌是不是有控制实际效果。不一样含量的SHP对肉食品中的六种有危害菌开展解决，选用牛津杯法，见图1，仔细观察抑菌圈的形成状况来判断SHP对六种菌的抗菌实际效果，及其随SHP浓度值转变的抗菌发展趋势。抑菌圈的尺寸展现了SHP抗菌实际效果的高低，抑菌圈越大表明SHP的抗菌作用越好。

图1中，牛津杯的外直徑为8.0mm。下列实验中解决的试品要是没有超过8.00mm的清楚的抑菌圈，视作沒有杀菌作用。