细菌黑色素是天然色素的主要来源于，具备与众不同的制造优点和生物活性，关键有红、黄、蓝三大色调。相对性于鲜红色黑色素，细菌淡黄色黑色素的类型较少，但在食品类、护肤品等领域有着广泛的行业前景。现阶段已发觉产淡黄色黑色素的细菌关键有(1)红曲霉属(Monascusspp)造成萘醌类红曲黄色素，并已商业化的生产制造；(2)曲霉属(Aspergillus)A．cristatus和A．xavus造成甲基萘醌类黄色素；(3)青霉属Penicilliumcitreonigrum造成黄色素；(4)散囊菌属Eurotiumrubrum代谢萘醌类黄棕色黑色素。而Simplicillium属细菌造成的黑色素则末见报导。

本试验室从蓝藻细胞培养液中分离出来出一株相互依存细菌Simpliciiliumlanosoniveum(DT06)。该细菌在沙氏培养液中生成一种新的抗菌素、胞外含糖量和少量的黑色素，而在含碳量无机物培养液中则很多生成黄色素(DT06黑色素)，这也是第一次发觉Simplicillium属的细菌可以生成黑色素。文中对DT06黑色素开展分离纯化、表现，科学研究其抗氧化和可靠性，并选用Plackett—Burman和响应面设计方案，对其发醇培养液成份开展提升，为该黑色素的进一步运用打下基础。

一、原材料与方式

1、原材料

（1）菌苗与培养液

细菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum)由河北工业高校代谢工程试验室分离出来，现储藏在中科院微生物菌种研究室菌物标本馆，储藏序号HMAS242045。PDA培养液(1L)：土豆200g，葡萄糖水20g，琼脂粉15g，pH当然。

改进BG-11培养液(1L)：NaNO₃0.76g，K₂HP0₄0.48g，MgS0₄·7H₂0O.075g，CaCl₂·2H₂00.036g，葡萄糖水18g，Criticacidstock(CS)10mL，Tracemetalmix(TM)lmL，pH当然。

（2）原材料、仪器设备与机器设备

2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二氨盐(ABTS)、1，1-二苯基-2-三磺酰氯肼(DPPH)：南京市奥多福尼生物技术有限责任公司；别的分析纯化工品均购自南开大学科威企业。

Agilent-1200高效率液相色谱：英国Agilent企业；CARy300型紫外线光谱仪：上海精科仪器厂；RE-5205旋转蒸发器：上海亚荣生物化学仪器厂。

2、方式

（1）发醇方式

将4℃储藏的细菌DT06注射于PDA斜坡培养液上，25℃塑造5d，无菌检测情况下配置成胞子混液，注射于100／250mLBG-11培养液中，在25℃、130r／min标准下摇床塑造36h做成种籽液，以l％的接种量把种籽液接转到80／250mL改进BG-11培养液中，在同样情况下摇床塑造7d。

（2）黑色素的剥离与提纯

将发酵物在8000r／min标准下离心式10min，去除菌丝，搜集上清液。500mL上清液中添加300mL硫酸碱化的乙酸丁酯，充足波动，静放取顶层乙酸丁酯提取液。渗沥液低电压水蒸气蒸馏去除乙酸丁酯，获得的黑色素用工业甲醇融解，再用0．22μm滤纸过虑，获得高纯工业甲醇黑色素水溶液。

（3）黑色素的色谱及成分计算方式

将获得的高纯黑色素水溶液用适当工业甲醇稀释液，用紫外线-由此可见光度计开展全股票波段扫描仪(200～800nm)，以明确较大消化吸收光波长。

选用Agilent-1200高效率液相色谱开展剖析，色谱仪标准：C18(Kromasil)离子交换柱(250mm×4．6mm，5μm)；进样量：20μL；柱温：25℃，紫外线-能见光探测器。在以上情况下检验DT06黑色素的最好流动性相及流动速度。

在色素沉着的最高消化吸收光波长下，用OD值值表明黑色素成分，黑色素成分表明为较大消化吸收光波长下1ml回应发酵物的OD值值。

（4）黑色素的清除自由基活力

各自测量细菌DT06黑色素对DPPH氧自由基、ABTS氧自由基、超氧自由基和羟基自由基的清理工作能力。DPPH氧自由基、ABTS氧自由基和超氧自由基的清除率计算方法为：[1-(A₁-A₂)／A₀]×100；羟基自由基清除率计算方法为：(A₁-A₀)／(A₂-A₀)×100，在其中A₁、A₂和A₀各自为对照组、对照实验和空缺组的吸光度值。同样情况下，用等浓度值的维他命C做阳性对照。

（5）黑色素的可靠性

各自取一定量的黑色素水溶液于具塞试管婴儿中，科学研究不一样溫度(4、20、40、60、80、100℃)、阳光照射(黑喑、阳光照射、紫外线、12000LX)、pH(2、4、6、8、10)对其稳定的危害，每24h抽样一次，用280nm处的OD值值表明黑色素成分。

（6）培养液各成分的提升

在BG-11培养液的根基上，运用Plackett-Burman(PB)试验设计，科学研究葡萄糖水(X₁)、NaN0₃(X₂)、K₂HP0₄(X₃)、MgS0₄·7H₂0(X₄)、CaCl₂‘2H₂0(X₅)、CS(X₆)、TM(X₇)对细菌DT06生产制造黑色素(Y)的危害，在PB实验方案设计結果的根基上，用Box-Behnken设计方案(BBD)开展响应面提升。

二、結果与探讨

1、黑色素的色谱

碱化的乙酸丁酯提取液经蒸馏、工业甲醇复溶获得高纯黑色素水溶液，呈淡黄色(图1)。DT06黑色素能溶解于水，有别于A．cristatus产的黄色素。黑色素甲醇溶液的紫外线由此可见扫描仪光谱仪如图所示2a所显示，在285nm上有特点消化吸收峰，与P．citreonigrum和E．rubrum黄色素各自在330nm和396nm处的特点消化吸收峰不一样，285nm能够 做为检验光波长用以高效液相色谱色谱和黑色素成分测量。
 

依据着色剂的正负和离子交换柱的类型来挑选适宜的流动性相和流动速度，最后明确当流动性相为乙腈：水(2:8，V/V)、流动速度为0.8mL／min时离子交换柱对黑色素的分离出来实际效果最好是，如图所示2b所显示，在10.52min上下发生单一峰(7.84min为工业甲醇有机溶剂峰)，峰形险峻、对称优良，说明黑色素纯净度较高。