（5）抗菌成分的胰蛋白酶水解作用试验

选用两层琼脂粉蔓延法，将10mL杀菌素琼脂粉固体培养基倒进无菌检测细胞培养皿中，待彻底凝结后做为最底层培养液，每皿按方形四角部位轻放进4个无菌检测牛津杯，将0.1mL浓度值为l×10⁸CFU／mL的标示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固体培养基中，当心搅拌后倒至最底层培养液上，留意不能加到牛津杯里，待其彻底凝结，做为菌层培养液。当心取下牛津杯，留意不能影响已产生的孔眼，向直径大约为8mm孔眼内添加待检CFS，37℃厌氧发酵塑造18h后，精确测量抑菌圈直徑。选用大肠埃希菌和金黄链球菌做为指示菌，与此同时用盐水做为对比。选择抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种作事后科学研究抗菌试验中抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种CFS，各自调整pn为胰蛋白酶K、胃蛋白酶和蛋白酶的适宜功效pH，按1.0mg／mL各自添加胰蛋白酶K(适宜pH7.0)、胃蛋白酶(适宜pH2.0)、蛋白酶(适宜pH7.0)，37℃下温育1h，将CFS的pH调返回5.0，牛津杯法精确测量其抑菌圈直徑，反复3次，以没经胰蛋白酶解决过的pH=5.0的CFS为对比。认证乳酸菌饮料CFS的抗菌活性物质是不是为蛋白质类。

（6）乳酸菌饮料组织学特点观查

选用两层琼脂粉蔓延法，将10mL杀菌素琼脂粉固体培养基倒进无菌检测细胞培养皿中，待彻底凝结后做为最底层培养液，每皿按方形四角部位轻放进4个无菌检测牛津杯，将0.1mL浓度值为l×10⁸CFU／mL的标示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固体培养基中，当心搅拌后倒至最底层培养液上，留意不能加到牛津杯里，待其彻底凝结，做为菌层培养液。当心取下牛津杯，留意不能影响已产生的孔眼，向直径大约为8mm孔眼内添加待检CFS，37℃厌氧发酵塑造18h后，精确测量抑菌圈直徑。选用大肠埃希菌和金黄链球菌做为指示菌，与此同时用盐水做为对比。抗菌试验中抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种注射于MRS固态平板电脑上四划分线，37℃厌氧发酵塑造48h，观查固态平板电脑上的菌体形状特点并挑菌单菌体开展革兰氏染色试验，镜检查观查菌体上色結果和组织学特点。

（7）菌种鉴定

①生理学生物化学评定试验

参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中的实验方法，选用两层琼脂粉蔓延法，将10mL杀菌素琼脂粉固体培养基倒进无菌检测细胞培养皿中，待彻底凝结后做为最底层培养液，每皿按方形四角部位轻放进4个无菌检测牛津杯，将0.1mL浓度值为l×10⁸CFU／mL的标示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固体培养基中，当心搅拌后倒至最底层培养液上，留意不能加到牛津杯里，待其彻底凝结，做为菌层培养液。当心取下牛津杯，留意不能影响已产生的孔眼，向直径大约为8mm孔眼内添加待检CFS，37℃厌氧发酵塑造18h后，精确测量抑菌圈直徑。选用大肠埃希菌和金黄链球菌做为指示菌，与此同时用盐水做为对比。抗菌试验中抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种开展生理学生物化学评定。

②16SrRNA遗传基因保守序列增加

选用两层琼脂粉蔓延法，将10mL杀菌素琼脂粉固体培养基倒进无菌检测细胞培养皿中，待彻底凝结后做为最底层培养液，每皿按方形四角部位轻放进4个无菌检测牛津杯，将0.1mL浓度值为l×10⁸CFU／mL的标示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固体培养基中，当心搅拌后倒至最底层培养液上，留意不能加到牛津杯里，待其彻底凝结，做为菌层培养液。当心取下牛津杯，留意不能影响已产生的孔眼，向直径大约为8mm孔眼内添加待检CFS，37℃厌氧发酵塑造18h后，精确测量抑菌圈直徑。选用大肠埃希菌和金黄链球菌做为指示菌，与此同时用盐水做为对比。

将抗菌试验中抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种开展病菌基因的获取，依照已买病菌DNA获取检测试剂盒使用说明试验操作流程开展。

③菌种鉴定并搭建系统软件进化树

取5μL增加精彩片段100V工作电压下，1％琼脂糖电泳原理观查結果(尺寸应是1500bp上下)。认证后的电泳条带胶回收利用检测试剂盒回收利用，回收利用物质送上海生工生物技术有限责任公司转录组测序。将菌种16SrRNA高通量测序結果与GenBank数据库查询中已经知道菌种保守序列开展核对，根据MEGAX手机软件剖析目地基因序列的开放阅读框，并搭建系统发育树。

4、数据处理方法

每一个试验3个平行面，数据信息用x^–±s表明。

二、結果与剖析

1、乳酸菌饮料菌种分离出来

从安徽省当地酸菜中国共产党分离出来得到10个溶钙圈的乳白色单菌体，经初始评定得到6株乳酸菌饮料，进一步挑选提纯后依照菌种来源于和挑菌次序取名。

2、抗菌试验結果

抗菌试验結果如图所示1所显示，菌种PC-3对2种指示菌抑菌圈直徑较大，抗菌实际效果最好是，对大肠埃希菌和金黄链球菌的抑菌圈直徑各自做到17.17 0.42mm和19.23±0.61mm。结果显示该菌种对大肠埃希菌和金黄链球菌有极强的杀菌作用。缘故可能是乳酸菌饮料在成长新陈代谢的环节中形成了有机物、H₂0₂或病菌素，进而控制了标示病菌的生长发育。挑选PC-3号菌种做为事后试验菌种。

3、菌种PC-3生长曲线图和产酸曲线图的测量

菌种PC-3生长曲线图和产酸曲线图如图2所显示，该菌种在0～12h处在延滞期，生长发育迟缓，延滞期相比较长。菌种PC-3在12h后进到对数期，菌体细胞快速繁衍生长发育，在36h菌体细胞数做到最高值。在菌体进到多数成长期后菌液的pH快速减少，稳定型时pH保持在4.0上下。
 

4、有机物和双氧水清除抗菌试验結果

菌种PC-3CFS对二种指示菌的抑制效果，可能是菌种PC-3新陈代谢生成的病菌素或酸碱性尾端物质如有机物或双氧水功效的結果。如图所示3所显示，pH=5.0的菌种Pc-3CFS与初始CFS抗菌实际效果对比，对大肠埃希菌和金黄链球菌的抑菌圈直徑各自降低了7.0％和6.6％，表明pH=5.0的菌种Pc-3CFS与初始CFS抗菌实际效果相仿，事后实验中抗菌实际效果比较能够 pH=5.0做为pH调整标准；pH=5.0的乳酸菌和甲酸对照实验对二种指示菌的抑菌圈直徑显著减少，抗菌实际效果非常明显变弱，表明清除乳酸菌和甲酸的影响后，CFS中还出现别的抗菌化学物质，菌种PC-3CFS中起关键杀菌作用的化学物质并不是有机物类。