乳酸菌饮料是一类可发醇运用糖类与碳水化合物并产乳酸菌的革兰氏阳性菌的统称。具备调整肠胃内有益菌构造、改进肠胃微自然环境，减少血清蛋白碳水化合物等生理作用。乳酸菌饮料还做为一种主要的工业生产微生物菌种，广泛运用于制做生抽、熏肠、酸菜等食品类发醇领域。

现阶段医疗设备上抗菌素的乱用产生了严重威胁，很多耐药性基因突变菌种的发生让大家无计可施，急待发觉一类新式翠绿色抑菌化学物质来替代抗菌素，病菌素被觉得是当前最好的抗菌素代替品。病菌素是由乳酸菌饮料造成的具备抗菌活力的肽类或蛋白质类化合物，普遍出现于乳酸菌饮料新陈代谢物质中。做为一种蛋白质类化合物，病菌素可被胰蛋白酶水解反应而不容易残余于人或动植物身体，不容易造成抗药性，因而具备较高的安全系数。病菌素还能抑制片革兰阴性杆菌、李斯特菌、梭菌、橙黄色链球菌等腐坏菌的生长发育，被认可为食品保藏技术性中最具备开发设计和应用前景的化学物质。

近些年，产病菌素乳酸菌饮料的挑选与评定在全国各地多种多样酸菜科学研究中多有报导。但在河南当地酸菜中却末见报导。文中从安徽省当地酸菜中挑选对大肠埃希菌和金黄链球菌有抑制效果的乳酸菌饮料菌种，获得菌种L.plantarumPC-3，对其开展生理学生物化学和生物学试验评定，并明确其所产关键抗菌物质的性质，为开发设计食品类运送和贮存历程中操纵有危害菌的拮抗作用中药制剂考虑菌种和具备新式微生物添加剂作用的病菌素造成菌给予了理论来源。

一、原材料与方式

1、原材料与实验试剂

酸菜：安徽省家中自做，源自安徽省当地新鮮介菜2500g，清洗，当然晾晒，放进清洗晒干的广口泡菜坛底端，添加500g食用盐，擦抹匀称，再向泡菜坛中添加冷水至坛口处，留意不必淹没坛口，盖紧坛盖，在坛口边缘处添加少量冷水密封性。置荫凉干躁处，三个月后就能服用。标示菌种：大肠埃希菌(ATCC8099)，橙黄色链球菌(ATCC6538)，购自安徽省艾浮地艾空气过滤检验站，来自我国一般微生物菌种菌种保藏管理处。

MRS琼脂粉培养液、MRS液体培养基、LB液体培养基：青岛市新科技工业园区海博生物技术性有限责任公司；明胶液化培养液、磷酸盐复原试验培养液：广东环凯微生物菌种高新科技有限责任公司；精氨酸产氨试验对比生物化学管、SIM培养液、糖发醇生物化学管：青岛市新科技工业园区海博生物技术性有限责任公司；琼脂粉：索莱宝生物技术有限责任公司；过氧化氢酶(2500U／mg)、蛋白酶(250U／mg)、胃蛋白酶(3000U／mg)：上海市蓝季生物技术有限责任公司；胰蛋白酶K(33.5U／mg)：德国默克MERCK；病菌基因DNA获取检测试剂盒、琼脂糖电泳DNA回收利用检测试剂盒、DL2000DNAMarker：天根生化高新科技有限责任公司；化学药品均为分析纯。

2、仪器设备与机器设备

梯度方向PCR仪：英国ABI企业，核苷酸电泳仪：北京六一仪器厂；AlphaImagerHP莹光／能见光凝胶成像数据分析系统：英国Alpha企业；S201-KpH计：梅特勒企业；SW-CJ-lF單人两面超净工作台：苏州净化机械厂；生物显微镜：上海一恒高新科技有限责任公司；SHP-100生化培养箱：扬中市三发电子器件有限责任公司；LS-B50L电加热器式灭菌设备：江阴市各地诊疗机械厂；GL-16G-11快速冷冻离心机：上海安亭科学研究仪器厂。

3、方式

（1）乳酸菌饮料的分离出来

无菌检测情况下将酸菜与液汁混和匀称，取1mL液汁加至9mL杀菌盐水中，做成1:10的试品匀液，充足震荡后按以上实际操作次序，做10倍增长稀释液试品匀液，挑选2～3个持续的适合稀释液度，每一个稀释液度汲取0.1mL试品匀液各自施胶于含1％CaC03的MRS固体培养基上，37℃厌氧发酵塑造48h；挑菌有溶钙圈的乳白色单菌体，在MRS固态平板电脑上划线挑选，选择单一菌体，进一步画线分离纯化，挑菌单一菌体注射至MRS斜坡上，搞好标识，4℃储存预留。

(2)抗菌试验

①乳酸菌饮料无体细胞发醇上清液(cell-freefermentationsupematant，CFS)的制取2％接种量注射生长发育至对数期的菌液于MRS液体培养基中，37℃厌氧发酵塑造48h，4℃、8000r／min离心式10min，搜集发醇上清液，0.45μL滤纸过虑，4℃储存预留。

②牛津杯法抗菌试验

选用两层琼脂粉蔓延法，将10mL杀菌素琼脂粉固体培养基倒进无菌检测细胞培养皿中，待彻底凝结后做为最底层培养液，每皿按方形四角部位轻放进4个无菌检测牛津杯，将0.1mL浓度值为l×108CFU／mL的标示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固体培养基中，当心搅拌后倒至最底层培养液上，留意不能加到牛津杯里，待其彻底凝结，做为菌层培养液。当心取下牛津杯，留意不能影响已产生的孔眼，向直径大约为8mm孔眼内添加待检CFS，37℃厌氧发酵塑造18h后，精确测量抑菌圈直徑。选用大肠埃希菌和金黄链球菌做为指示菌，与此同时用盐水做为对比。选择抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种作事后科学研究。

③乳酸菌饮料的产酸曲线图与生长曲线图的测量

选用两层琼脂粉蔓延法，将10mL杀菌素琼脂粉固体培养基倒进无菌检测细胞培养皿中，待彻底凝结后做为最底层培养液，每皿按方形四角部位轻放进4个无菌检测牛津杯，将0.1mL浓度值为l×108CFU／mL的标示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固体培养基中，当心搅拌后倒至最底层培养液上，留意不能加到牛津杯里，待其彻底凝结，做为菌层培养液。当心取下牛津杯，留意不能影响已产生的孔眼，向直径大约为8mm孔眼内添加待检CFS，37℃厌氧发酵塑造18h后，精确测量抑菌圈直徑。选用大肠埃希菌和金黄链球菌做为指示菌，与此同时用盐水做为对比。选择抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种作事后科学研究。抗菌试验中抑菌圈直徑较大的乳酸菌饮料单菌体，连接MRS液体培养基中，37℃厌氧发酵塑造48h，以2％接种量将种籽液接站MRS液体培养基中开展繁衍塑造，各自在0、2、4、6，8，10，12、14716，18720，22，24，26，28、30、32、34、36、38、40、42、44、48h时抽样，于光波长600am处测量OD600和培养液的pH，以塑造時间为横坐标轴，以pH和OD600数值纵轴，制作塑造時间一光密度、pH标曲。

（4）有机物、双氧水杀菌作用清除试验

选用两层琼脂粉蔓延法，将10mL杀菌素琼脂粉固体培养基倒进无菌检测细胞培养皿中，待彻底凝结后做为最底层培养液，每皿按方形四角部位轻放进4个无菌检测牛津杯，将0.1mL浓度值为l×108CFU／mL的标示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固体培养基中，当心搅拌后倒至最底层培养液上，留意不能加到牛津杯里，待其彻底凝结，做为菌层培养液。当心取下牛津杯，留意不能影响已产生的孔眼，向直径大约为8mm孔眼内添加待检CFS，37℃厌氧发酵塑造18h后，精确测量抑菌圈直徑。选用大肠埃希菌和金黄链球菌做为指示菌，与此同时用盐水做为对比。选择抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种作事后科学研究。抗菌试验中抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种CFS，将CFS的pH中合至5.0后，按选用两层琼脂粉蔓延法，将10mL杀菌素琼脂粉固体培养基倒进无菌检测细胞培养皿中，待彻底凝结后做为最底层培养液，每皿按方形四角部位轻放进4个无菌检测牛津杯，将0.1mL浓度值为l×108CFU／mL的标示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固体培养基中，当心搅拌后倒至最底层培养液上，留意不能加到牛津杯里，待其彻底凝结，做为菌层培养液。当心取下牛津杯，留意不能影响已产生的孔眼，向直径大约为8mm孔眼内添加待检CFS，37℃厌氧发酵塑造18h后，精确测量抑菌圈直徑。选用大肠埃希菌和金黄链球菌做为指示菌，与此同时用盐水做为对比。选择抑菌圈较大的乳酸菌饮料菌种作事后科学研究流程做抗菌试验，并设pH=5.0的甲酸、乳酸菌和初始未调pH的CFS为对比，反复3次，精确测量抑菌圈直徑。取过氧化氢酶水溶液0.1mL，加至0.9mLpH=5.0的CFS中，使过氧化氢酶终浓度值为50U／mL，并设没加过氧化氢酶的pH=5.0CFS和初始未调pH的CFS为对比，反复3次，牛津杯法精确测量其抑菌圈直徑。认证乳酸菌饮料CFS的关键抗菌活性物质是不是为有机物和双氧水。