沙门菌(Salmonella)病又被称为副伤寒，是一种在皮毛小动物饲养全过程常用的急性传染病，常发于6—8月，呈地区性时兴，关键表现症状为发烫，下痢拉肚子，体重下降，发生脑出血症状，小产等。美国、荷兰、澳大利亚等国均有北美水貂(Mustelavison)感柒沙门菌生病的报导，中国，在中国河北省、东北三省、山东省等地域也是有有关病例报道。现阶段，沙门菌的防止与医治以抗生素药物为主导。近些年对沙门菌的抗药性科学研究数据显示，人源、小动物源沙门菌的多重耐药状况和耐药性水平日益增长，并根据饮用水和食品等方法在动物和人中间持续传送。抗菌素类药物滥用，给病菌导致挑选工作压力是导致多重耐药状况日益比较严重的首要缘由之一，因而，在养殖业中有效运用医治动物疾病至关重要。

为调研秦皇岛市地域北美水貂沙门菌的诊断率及耐药性状况，对65份水貂试品中的病菌开展分离纯化，选用病菌的评定塑造、革兰氏染色、生物化学评定和16SrDNA评定分离出来菌，选用小白鼠高致病实验科学研究分离出来菌种的高致病，选用KB纸条法检验分离出来菌的抗药性。数据显示，经评定总共分离出来出9株沙门菌，分离出来率13.85%(9/65)；9株沙门菌均可致小白鼠病发身亡，致死率20%—100%；9株沙门菌各自对5—11种抗生素药物耐药性，氟苯尼考、替米考星、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和复方新诺明的耐药性率达到100%，土霉素比较敏感率最大，为88.89%(8/9)。以上科学研究结果显示，秦皇岛市地域从水貂分离出来到的沙门菌均具备一定的发病力和多重耐药性，为该地域水貂沙门氏菌病的预防给予参照。

文中对2019年秦皇岛市地域复检北美水貂的沙门菌带上状况开展调研，并对分离出来菌种的致病和抗药性开展科学研究，致力于为该地域北美水貂沙门氏菌病的预防给出的数据适用。

1原材料与方式

1.1试品

2019年3—9月搜集秦皇岛市地域病亡北美水貂病料65份，30—180日龄不一。

1.2关键实验试剂

H.E.琼脂粉培养液购自青岛海博生物公司；革兰氏染色液购自京博创脉达高新科技有限责任公司；ID32E肠杆菌科和其它非苛养革兰氏阳性菌呈阴性链球菌评定实验试剂条购自法国的贝克曼库尔特企业；D2000plusDNAladder，购自中科瑞泰科技有限责任公司；2×TaqMasterMix，病菌DNA基因获取检测试剂盒，胶回收利用检测试剂盒购自康为世纪生物技术有限责任公司；pMD19-T媒介，购自宝日医(TaKaRa)生物科技有限责任公司；药敏试验纸条购自杭州市天宇微生物菌种科技发展有限责任公司；编码序列测量服务项目由上海生工生物技术企业给予。昆明市小白鼠(休重20±5g)购自北京市维通利华实验小动物有限责任公司。

1.3引物设计

病菌16SrDNA评定通用引物由上海生工生物技术企业生成。引物设计编码序列为27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

1.4病菌的分离纯化

无菌检测采用病亡水貂肝部、肝脏、心血管，于洁净台中注射于H.E.琼脂粉培养液，放置37℃恒温培养箱中塑造18—24h，挑菌黑绿色且核心有小黑点的菌体再次于H.E.培养液中划线提纯塑造18—24h，挑菌合乎以上特点的单菌体注射于LB培养基中，放置37℃振荡培养箱塑造18—24h。

1.五分离菌的革兰氏染色

挑菌提纯后的单菌体开展革兰氏染色，上色实际操作依照实验试剂使用说明开展，上色后在显微镜下观查病菌的上色特点和形状。

1.六分离菌的生物化学评定

生物化学评定实验参考ID32E肠杆菌科和其它非苛养革兰氏阳性菌呈阴性链球菌评定实验试剂条开展，用ATB全自动生物化学评定对系统結果判断。

1.7分离出来菌的16SrDNA评定

依照病菌DNA基因获取检测试剂盒使用说明获取分离出来菌的DNA做为PCR模版。PCR管理体系为：上、中下游引物设计和模版各1μL，ddH2O22μL，2×TaqMasterMix25μL，总容积为50μL。PCR扩增反映程序流程为：94℃预转性5min；94℃转性30s，55℃淬火30s，72℃拓宽60s，共30个循环系统；72℃拓宽10min。用胶回收利用检测试剂盒回收利用1500bp上下杂带，回收利用物质联接pMD19-T媒介并转到DH5α感受态细胞，施胶于带有氨苄青霉素的LB琼脂粉培养液塑造，挑菌阳性菌落放置含氨苄青霉素的LB培养基中繁衍塑造，送上海生工生物技术企业转录组测序。转录组测序結果在NCBI的BLAST系统分区查找并核对剖析。

1.8分离出来菌的高致病实验

论文参考文献中的使用量与方式，每棵分离出来菌各自感柒5只小白鼠，每只小白鼠腹部注入0.2mL用高压灭菌后的PBS调节浓度值后的菌液(浓度值1×108cfu/mL)，设定对照实验一组，每只小白鼠注入0.2mL的无菌检测PBS，其他标准与分离出来菌感柒组同样。观查并纪录小白鼠身亡病发状况。

1.9分离出来菌的药品敏感实验

依照英国临床医学和实验室规范研究会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)规范的操作方法和判准，选用KB纸条法检验分离出来菌对β-内酰胺类(氨苄西林、头孢曲松钠、阿莫西林胶囊)，氨基糖苷类(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四环素类(盐酸多西环素、土霉素)，氟喹诺酮类(环丙沙星、恩诺沙星)，氯霉素类(氟苯尼考)，大环内酯(替米考星)，磺胺类(磺胺间甲氧、磺胺二甲氧、复方新诺明)，总共15种抗菌素的敏感度。

2結果

2.1病菌的分离纯化

从65份样本中总共分离出来出9株疑是沙门菌的菌种。疑是菌种在H.E.琼脂粉培养液塑造菌体正圆形，边沿齐整，微突，深蓝色，菌体正中间有小黑点(图1A)。

2.2分离菌的革兰氏染色

经革兰氏染色，9株分离出来菌均为革兰氏阳性菌呈阴性短链球菌，两边钝圆(图1B)。