1.3.5 反复精彩片段基因指纹剖析

以病菌基因DNA为模版，参照Silva等的方式 ，运用设计方案的BOX引物设计（引物设计编码序列见表2）开展rep-PCR扩增。待增加进行后，将PCR物质开展1.5%的琼脂糖电泳电泳原理并在UＶ灯下观查电泳原理結果。

1.3.6 系统发育树

将校准并拼凑后的编码序列在GenBank中开展同宗编码序列的检索，由rep-PCR获得的大概杂带状况，从差别可能考虑，选用层级UPGMA法（UnweightedPair-GroupMeanAverage），依据供试菌种的rep-PCR扩增杂带的尺寸，选用二进制方式，转化成系统发育树。

1.3.7 质粒提取

将产病菌素枯草芽孢菌菌种留宿塑造，运用质粒提取检测试剂盒（OMEGAbio-tek，上海市），依据检测试剂盒上的讲解对留宿塑造的产病菌素枯草芽孢菌菌种开展质粒提取。将获取好的质粒DNA在1.5%的琼脂糖电泳下开展电泳原理并在UＶ灯下观查电泳原理結果。

1.3.8 病菌素粗提

1.3.8.1 硫酸铵蛋白质变性离子交换法

按1%接种量将留宿塑造好的产病菌素枯草芽孢菌注射到250mL的BHI液体培养基中，放置30℃塑造最少12h。将以上留宿塑造好的菌液于4℃，10000r/min离心式标准下离心式25min，在上清液中加上45%的饱和状态硫酸铵拌和融解，放置4℃留宿。将留宿的水溶液在10000r/min标准下离心式30min，将沉积融解于5mL聚磷酸盐缓冲溶液PBS（pH6.86）中，即获得病菌素粗提物。

1.3.8.2 疑胶过虑层析

以SephadexG-25为疑胶填充料，超纯水系统开展预过柱后再用PBS过柱柱头，病菌素粗提物5mL上样，流动速度0.5mL/min，先应用PBS开展过柱，以后用0.2，0.5mol/L的氧化钠（NaCl）先后开展过柱，搜集过柱液。各自对采集的过柱液开展抗菌实验（汲取2μL粗提物抑止蜡样枯草芽孢菌），将有抗菌实际效果的过柱液开展干冻浓缩后复溶解pH6.86的PBS中放置-20℃预留。

1.3.9 三羟甲基甘氨酸-SDS-PAGE电泳原理（Ｔricine-SDS-PAGE）

参照Schagger等的方式 ，将干冻浓缩好的病菌素粗纯化化学物质在ＴricineSDS-PAGE开展电泳原理。在其中胶质量浓度各自为隔层胶10%，浓缩胶4%，分离出来胶16.5%。选用分子质量3.3～20.1ku的肽Marker（Solarbio）做为规范对比。电泳原理完毕后应用考马斯亮蓝G250开展上色褪色，将电泳原理胶在Bio-rad显像系统软件下纪录結果。

1.3.10 液相色谱仪-串联质谱联用

将产病菌素枯草芽孢菌菌株在30℃标准下留宿塑造，将塑造好的菌液在10000r/min标准下离心式30min，取上清液加温15min解决后，参照Sun等的方式 ，将上清液根据液相色谱仪-串联质谱联用剖析蛋白质分子品质。运用目前蛋白组学资料库（Omicsbean）对得到的蛋白开展数据分析。

2 結果与探讨

2.1 产病菌素菌种的挑选及评定

从杜蛎中基本挑选出的对普遍食源性病原菌有抗菌活力的菌种有14株（取名为O、S、18、19、26、27、4、6、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2）。这种病菌在板材上具备典型性的枯草芽孢菌形状，即菌体平扁、不光滑不全透明、边沿不齐整、微淡黄色，且革兰氏染色后結果均呈阳性。这14株菌对普遍病原菌的抗菌谱见表3。在其中O、18、19、26、27、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2等菌种具备广谱性抗菌性，不但对橙黄色链球菌（S.aureus）、蜡样枯草芽孢菌（Bacilluscereus）、乳酸菌（L.plantanrum）等革兰氏阳性菌具备不错的抗菌实际效果，并且对弗氏柠檬酸钠链球菌（C.freundii）、副血溶弧菌（V.parahemolyticus）、大肠埃希菌（E.coli）、肠胃沙门菌（S.enterica）、福氏志贺氏菌（Shigellaflexneri）等革兰氏阳性菌阴性菌也有着不错的抑制效果。此外，由表3还能够看得出，菌种18、19、26、27具备类似的抗菌谱，菌种F1、F2、F4、Y1、Y2等抗菌工作能力也十分相似。

将具备抗菌活力的病菌送检验序，其转录组测序結果历经在NCBI上开展Blast序列比对，发觉这14株指标值菌种与枯草芽孢菌属开放阅读框最大，均达到99%之上，可分析判断其均归属于枯草芽孢菌属。在其中，O为解木薯淀粉枯草芽孢菌（B.amyloliquefaciens），18、19、26、27及其F1、F2、F4、Y1和Y2等菌种均为枯草枯草芽孢菌（B.subtilis），4、6、S各自为简短枯草芽孢菌（B.pumilus）、厦门市枯草芽孢菌（B.xiamenensis）、蜡样枯草芽孢菌（B.cereus），4-1为死谷枯草芽孢菌（B.vallismortis）。

2.2 病菌素对热和酶的稳定性测试

病菌生长发育历程中形成的抗菌化学物质除开病菌素外，还能够新陈代谢造成有机物、抗菌素和H2O2等其他具备抗菌活力的化学物质。为了更好地清除其他影响要素，根据加温解决和酶处理方法明确抗菌化学物质为病菌素。挑选出的14株菌在升温后维持不错的抗菌活力。除此之外，历经胰蛋白酶K解决的平板电脑点菌处抑菌圈不详细，这一結果表明抗菌活性物质是耐热性强的病菌素。

2.3 反复精彩片段基因指纹剖析（rep-PCR）和系统发育树搭建

为了更好地明确同一属种的病菌基因型是不是一致，本实验根据使用独特制定的引物设计即BOX引物设计对抗菌谱类似且评定結果类似的菌种的DNA开展rep-PCR扩增，明确其对应的基因图谱，便于进一步对病菌开展区别。Rep-PCR扩增物质经琼脂糖电泳电泳原理后的結果如图所示1。数据显示，18、26、27的增加物质基因图谱基本一致，即反复精彩片段基本一致，能够判断为一种菌；F1、F2、F4、Y1、Y2等菌种的基因图谱也展现出一致性，可分辨为同一种菌；4-1与F1、F2、F4、Y1、Y2的rep-PCR扩增物质在＜1.0kb类似，但在＞1.0kb处杂带略有不同，分析判断是同为但不一样种的菌；O、S、4、6、4-1的杂带不尽相同，能够判定为同一属种的不一样菌。

依据rep-PCR扩增杂带結果，选用二进制方式，运用UPGMA手机软件搭建获得对应的系统发育树（如图2）。数据显示菌种Y1、F4、Y2、F2、F1的开放阅读框较高，此外，菌种18、26、27位于一个支系簇，该结论与rep-PCR結果一致。由于rep-PCR基因指纹图谱和系统发育树的結果，融合枯草芽孢菌抗菌谱范畴，能够分析判断O、19、F和4-1与其他病菌不一样，因而事后将采用这4株产病菌素枯草芽孢菌用以进一步实验。

2.4 质粒提取

病菌素是根据核糖体生成发生的抗菌化学物质。一般状况下病菌素根据在性染色体上编号造成，还可以根据质粒造成，也是有一些病菌素的生成是受性染色体和质粒的双向管控造成。为了更好地明确以上病菌素造成的部位，本实验根据获取质粒中DNA，分析判断编号病菌素的遗传基因是不是坐落于质粒，便于于进一步对编号病菌素的基因序列或是结构特征给予根据。結果发觉，这4株病菌未发觉质粒。这一結果表明这种枯草芽孢菌主要是根据性染色体上的编号遗传基因造成病菌素。